Текущая версия |
Ваш текст |
Строка 1: |
Строка 1: |
− | == Спектрофотометрическое исследование продуктов нингидриновой реакции ==
| |
| | | |
− | Разработка точных, доступных методов анализа а-[[Аминокислоты|аминокислот]] является одной из актуальных задач современной фармации, в данной статье описан простой и доступный способ определения аминокислот и [[протеин]]а в различных продуктах, включая [[Биологически активные добавки|биологически-активные добавки]] и [[спортивное питание]].
| |
| | | |
− | В настоящее время существует ряд методов количественного определения а-аминокислот в лекарственном растительном сырье, в лекарственных препаратах и биологических жидкостях [1—31]. Однако, несмотря на высокую точность, их применение ограничено длительностью приготовления рабочих растворов (потенциометрическое титрование в неводной среде), дороговизной оборудования (ГЖХ, ВЭЖХ) [4, 6,27,28, 30].
| + | *Количественное определение глицина в таблетках |
− | | + | *Количественное определение протеина в продуктах |
− | Для анализа а-аминокислот также широко используют методы, основанные на реакции с нингидрином [1,3, 8,9, 11-20,23, 29].
| |
− | | |
− | Khan А. с соавторами изучили механизм нингидриновой реакции [29]:
| |
− | [[Image:Ningidrid.jpg|250px|thumb|right|Нингидриновая реакция]]
| |
− | На первой стадии реакции о-аминокислот с нингидрином (I) образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение - 2-аминоиндандион (II), участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона (III) и 2-иминоиндандиона (IV), которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин (V). Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин (VI).
| |
− | | |
− | Установлено, что характерная для большинства а-аминокислот пурпурная окраска(окраска Румана) обусловлена образованием дикетогидринденкетогидринамина (V), а также продукта параллельной реакции - гидриндантина (VI), который мало растворим в воде и растворим в органических растворителях - диметилсульфоксиде (ДМСО) и метилцелозольве. Поэтому, с целью повышения чувствительности реакции, по предположению авторов, наиболее рационально использовать растворы нингидрина в указанных растворителях. Максимальные значения оптической плотности продуктов реакции (при длине волны 575 нм) наблюдаются при соблюдении следующих условий ее проведения: температура реакционной смеси - 95 °С, pH — 5-6. Кроме того, реакцию необходимо проводить без доступа кислорода, в атмосфере азота.
| |
− | | |
− | Для детектирования продукта нингидриновой реакции используют спектрофотометры, флуориметры.
| |
− | | |
− | Широкое распространение в анализе аминокислот получили аминокислотные анализаторы [1,9,11,13—15, 17]. Данный метод основан на разделении аминокислот с помощью ионообменной хроматографии с последующим фотоколориметрическим определением продуктов реакции аминокислот с нингидрином. Применение аминокислотных анализаторов позволяет разделить исследуемый образец на отдельные компоненты и определить их количество быстро и с высокой точностью. Главным недостатком данного метода анализа является высокая стоимость оборудования, что делает его недоступным для большинства лабораторий.
| |
− | | |
− | Более доступными и простыми являются фотоколориметрические и спектрофотометрические методы анализа о-аминокислот, основанные на их взаимодействии с нингидрином. Так, В.А. Храмовым модифицирован метод определения диаминокислот по Чинарду [12]. Метод основан на образовании красно-коричневых продуктов взаимодействия диаминокислот с нингидрином с последующим фотоколориметрическим определением при длине волны 490 нм. Метод является специфичным: нейтральные аминокислоты, а также амины и диамины при pH 1 с нингидрином окрашенных продуктов не образуют. Несмотря на доступность и простоту данный метод не является универсальным для всех а-аминокислот и позволяет определить лишь диаминокислоты, из которых наибольшее практическое значение имеет незаменимая аминокислота лизин. Кроме того, этим методом можно определить пролин.
| |
− | | |
− | Разработана точная методика количественного определения кислоты аспарагиновой в лекарственном препарате «[[Аспаркам]]», основанная на ее взаимодействии с 1 % этаноловым раствором нингидрина и последующим определением оптической плотности продукта реакции при длине волны 568 нм. Метод отличается хорошей воспроизводимостью, относительная ошибка среднего результата составила ±2,25 % [19]. Кроме того, предложен спектрофотометрический метод анализа суммы аминокислот различных видов пыльцы, основанный на взаимодействии с 2 % этаноловым раствором нингидрина [11].
| |
− | | |
− | С этих позиций представляет интерес изучение спектральных характеристик продуктов нингидриновой реакции 20-ти наиболее важных в биологическом отношении а-аминокислот, оптимизация условий ее проведения с целью разработки точного и доступного метода количественного определения а-аминокислот в растительном сырье, субстанциях и суммарных лекарственных препаратах.
| |
− | | |
− | == Исследование спектральных характеристик продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне ==
| |
− | | |
− | В соответствии с ГФ XI наиболее часто в хроматографических методах анализа а-аминокислот используют 0,2 % раствор нингидрина в ацетоне [3, 8]. На этом основании мы изучили спектры продуктов реакции для 20-ти а-аминокислот с ОД % раствором нингидрина в ацетоне с целью создания нового метода количественного анализа аминокислот в различных объектах.
| |
− | | |
− | Нингидриновую реакцию проводили по методике, указанной в ФСП на кислоту глутаминовую в разделе «подлинность»: к 1 мл 2 % раствора а-аминокислоты прибавляют 1 мл свежеприготовленного 0,2 % раствора нингидрина в ацетоне и нагревают до появления сине-фиолетовой окраски [10]. Цистеин и тирозин, вследствие их низкой растворимости в воде, использовали в виде менее концентрированных 0,04 % растворов. После полного охлаждения продукты нингидриновой реакции каждой из 20-ти а-аминокислот разбавляли водой в различных соотношениях до получения значений оптической плотности максимумов поглощения от 0,4 до 1,0.
| |
− | | |
− | Исследование спектров поглощения в видимой области показало наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 399-405 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 19-ти из 20-ти а-аминокислот (рис. 1-4). Исключение составляет пролин, продукт реакции которого с нингидрином имеет один максимум поглощения в видимой области — при длине волны 416 нм, что объясняется отсутствием первичной аминогруппы в структуре данной аминокислоты.
| |
− | [[Image:Ningidr1.jpg|250px|thumb|right|Рис 1. Видимая область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr2.jpg|250px|thumb|right|Рис 2. Видимая область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr3.jpg|250px|thumb|right|Рис 3. Видимая область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr4.jpg|250px|thumb|right|Рис 4. Видимая область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с ОД % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | Исследована также УФ-область спектра продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и установлено, что все они также имеют два максимума поглощения в диапазонах длин волн 220-237 и 254-260 нм (рис. 5-8). Исключение составляет продукт реакции с пролином, максимумы поглощения которого составляют 299 и 343 нм.
| |
− | [[Image:Ningidr5.jpg|250px|thumb|right|Рис 5. УФ-область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr6.jpg|250px|thumb|right|Рис 6. УФ-область спектра продуктов взаимодействия а аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr7.jpg|250px|thumb|right|Рис 7. УФ-область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr8.jpg|250px|thumb|right|Рис 8. УФ-область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
| |
− | | |
− | Максимумы поглощения (в видимой и УФ-области) продуктов взаимодействия 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне представлены в таблице 1.
| |
− | | |
− | '''Таблица 1. Характеристика спектров поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне.'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>№</p></td><td>
| |
− | <p>а-Аминокислота</p></td><td colspan="2">
| |
− | <p>Максимумы поглощения</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>п/п</p></td><td>
| |
− | <p></p></td><td>
| |
− | <p>УФ-область</p></td><td>
| |
− | <p>Видимая область</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>[[Бета-аланин|Аланин]]</p></td><td>
| |
− | <p>231,251</p></td><td>
| |
− | <p>401, 567</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>[[Аргинин]]</p></td><td>
| |
− | <p>232,256</p></td><td>
| |
− | <p>400, 561</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>Аспарагин</p></td><td>
| |
− | <p>231,256</p></td><td>
| |
− | <p>400*568</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>[[D-аспарагиновая кислота|Аспарагиновая кислота]]</p></td><td>
| |
− | <p>230, 256</p></td><td>
| |
− | <p>400,564</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>Валин</p></td><td>
| |
− | <p>230, 257</p></td><td>
| |
− | <p>400, 560</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>[[Гистидин]]</p></td><td>
| |
− | <p>229, 255</p></td><td>
| |
− | <p>401, 568</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>7</p></td><td>
| |
− | <p>[[Глицин]]</p></td><td>
| |
− | <p>231,256</p></td><td>
| |
− | <p>401,568</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>[[Глутамин]]</p></td><td>
| |
− | <p>230, 256</p></td><td>
| |
− | <p>401,566</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>9</p></td><td>
| |
− | <p>Глутаминовая кислота</p></td><td>
| |
− | <p>230, 256</p></td><td>
| |
− | <p>400, 568</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>Изолейцин</p></td><td>
| |
− | <p>230, 257</p></td><td>
| |
− | <p>399, 565</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>11</p></td><td>
| |
− | <p>Лейцин</p></td><td>
| |
− | <p>237, 258</p></td><td>
| |
− | <p>400, 565</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>12</p></td><td>
| |
− | <p>Лизин</p></td><td>
| |
− | <p>230, 255</p></td><td>
| |
− | <p>400, 565</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>13</p></td><td>
| |
− | <p>[[Метионин]]</p></td><td>
| |
− | <p>230, 254</p></td><td>
| |
− | <p>401,566</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>14</p></td><td>
| |
− | <p>Серин</p></td><td>
| |
− | <p>230, 256</p></td><td>
| |
− | <p>401,567</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>[[Треонин]]</p></td><td>
| |
− | <p>230, 256</p></td><td>
| |
− | <p>402,567</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>16</p></td><td>
| |
− | <p>[[Тирозин]]</p></td><td>
| |
− | <p>228, 258</p></td><td>
| |
− | <p>400, 567</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>17</p></td><td>
| |
− | <p>[[Триптофан]]</p></td><td>
| |
− | <p>229,263</p></td><td>
| |
− | <p>401,568</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>18</p></td><td>
| |
− | <p>[[Цистеин]]</p></td><td>
| |
− | <p>230, 257</p></td><td>
| |
− | <p>401,566</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>19</p></td><td>
| |
− | <p>[[Фенилаланин]]</p></td><td>
| |
− | <p>230, 255</p></td><td>
| |
− | <p>401, 564</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>20</p></td><td>
| |
− | <p>Пролин</p></td><td>
| |
− | <p>299, 343</p></td><td>
| |
− | <p>416</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Из данных таблицы 1 видно, что для большинства а аминокислот характерны четыре максимума поглощения, два из которых находятся в УФ-области, в интервале длин волн 228-237 и 251-263 нм, и два - в видимой области, в диапазоне 399-402 и 560-568 нм.
| |
− | | |
− | == Оптимизация условий реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне ==
| |
− | | |
− | Как установлено нами выше, большинство продуктов реакции а-аминокислот с раствором нингидрина в ацетоне характеризуются единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обуславливает целесообразность использования данной длины волны в качестве аналитической.
| |
− | | |
− | Нами установлено, что продукты реакции, проведенной по методике, указанной в разделе 1.1, характеризуются низкой стабильностью во времени (для большинства а-аминокислот значение оптической плотности в диапазоне длин волн 399-400 нм и интервале 1-2 ч после начала реакции снижается более чем на 15 %). Поэтому нами изучены оптимальные условия реакции в зависимости от соотношения между ее компонентами (навески и объема раствора о-аминокислоты, объема ОД % раствора нингидрина в ацетоне), продолжительности и температурного режима реакции. Для анализа мы использовали фенилаланин.
| |
− | | |
− | С целью изучения влияния количественных соотношений между растворами фенилаланина и нингидрина на стабильность продукта реакции нами проведена серия экспериментов (табл. 2). Реакцию проводили при температуре 100 °С в течение 10 мин (до образования темно-фиолетовой окраски). Продукты после полного охлаждения разбавляли водой и измеряли значение оптической плотности при длине волны 400 нм. О стабильности продуктов реакции мы судили по величине снижения оптической плотности, % за период 1-2 ч после начала реакции.
| |
− | | |
− | '''Таблица 2. Оптимизация количественных соотношений компонентов реакции'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td rowspan="2">
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td colspan="3">
| |
− | <p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2">
| |
− | <p>Оптическая плотность продукта при λ=400 нм</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>Навеска фенилала нина, г</p></td><td>
| |
− | <p>Объем раствора фенилалани на, мл</p></td><td>
| |
− | <p>Объем 0,2 % раствора нингидрина в ацетоне, мл</p></td><td>
| |
− | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
| |
− | <p>Снижение значения за период 1-2 ч после начала</p>
| |
− | <p>реакции, %</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>7</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>0,02</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1:6</p></td><td>
| |
− | <p>0,72747</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,75</p></td><td>
| |
− | <p>0,25</p></td><td>
| |
− | <p>-</p></td><td>
| |
− | <p>0,06456</p></td><td>
| |
− | <p>-</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td><td>
| |
− | <p>0,5</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,60825</p></td><td>
| |
− | <p>6,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,25</p></td><td>
| |
− | <p>0,75</p></td><td>
| |
− | <p>1:4</p></td><td>
| |
− | <p>0,75645</p></td><td>
| |
− | <p>12,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1:5</p></td><td>
| |
− | <p>0,75235</p></td><td>
| |
− | <p>13,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>1,5</p></td><td>
| |
− | <p>1,5</p></td><td>
| |
− | <p>1:10</p></td><td>
| |
− | <p>0,76256</p></td><td>
| |
− | <p>14</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>7</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,25</p></td><td>
| |
− | <p>0,5</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,57195</p></td><td>
| |
− | <p>И</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,75</p></td><td>
| |
− | <p>0,5</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>041382</p></td><td>
| |
− | <p>9,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>9</p></td><td>
| |
− | <p>0,004</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td><td>
| |
− | <p>0,5</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,51826</p></td><td>
| |
− | <p>9</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>0,006</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td><td>
| |
− | <p>0,5</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,58310</p></td><td>
| |
− | <p>10</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>11</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td><td>
| |
− | <p>0,75</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,59274</p></td><td>
| |
− | <p>10,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>12</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td><td>
| |
− | <p>0,25</p></td><td>
| |
− | <p>1:2</p></td><td>
| |
− | <p>0,63057</p></td><td>
| |
− | <p>8,5</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Здесь и далее - показывает соотношения между объемами продукта реакции до и после их разведения водой (мл).
| |
− | | |
− | На основании полученных данных нами установлены оптимальные соотношения между компонентами реакции: 2,5 мл 0,2 % раствора о аминокислоты и 0,5 мл 0,2% свежеприготовленного раствора нингидрина в ацетоне. При соблюдении данных условий образуется наиболее стабильный продукт, характеризующийся максимальным значением оптической плотности при длине волны 400 нм,
| |
− | | |
− | Мы изучили также влияние продолжительности реакции во времени на величину и стабильность значения оптической плотности продукта (табл. 3). Реакцию проводили с учетом оптимизированных выше соотношений между ее компонентами при температуре 100 °С.
| |
− | | |
− | '''Таблица 3 Оптимизация продолжительности реакции во времени'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td rowspan="2">
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Продолжительность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2">
| |
− | <p>Оптическая плотность продукта при λ=400 нм</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
| |
− | <p>Снижение значения за период 1-2 ч после начала реакции, %</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>/</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>1:2</p></td><td>
| |
− | <p>0,32569</p></td><td>
| |
− | <p>10</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>1:2</p></td><td>
| |
− | <p>0,54934</p></td><td>
| |
− | <p>9</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,48458</p></td><td>
| |
− | <p>8,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,56588</p></td><td>
| |
− | <p>8</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,60825</p></td><td>
| |
− | <p>6,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>12</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,61945</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>7</p></td><td>
| |
− | <p>14</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,62521</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,64187</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>9</p></td><td>
| |
− | <p>16</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,62891</p></td><td>
| |
− | <p>7</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>18</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,59476</p></td><td>
| |
− | <p>8</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>11</p></td><td>
| |
− | <p>20</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,54398</p></td><td>
| |
− | <p>10</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Анализ данных таблицы 3 показывает, что наиболее стабильный продукт с максимальным значением оптической плотности образуется при проведении реакции в течение 15 мин. Более длительное нагревание приводит к разложению продуктов реакции со значительным снижением оптической плотности. При нагревании реакционной смеси менее 15 мин величина оптической плотности вначале незначительно возрастает, а затем наблюдается резкое снижение ее значения.
| |
− | | |
− | Далее мы изучили влияние температурного режима реакции на стабильность значения оптической плотности продукта при длине волны 400 нм. Реакцию проводили в диапазоне температур от 50 до 110 в течение 15 мин (табл. 4).
| |
− | | |
− | '''Таблица 4 Оптимизация температурного режима реакции'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td rowspan="2">
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Температурный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2">
| |
− | <p>Оптическая плотность продукта при λ=400 нм</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
| |
− | <p>Снижение значения за период 1-2 ч после начала реакции, %</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>50</p></td><td>
| |
− | <p>-</p></td><td>
| |
− | <p>0,0706</p></td><td>
| |
− | <p>- .</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>60</p></td><td>
| |
− | <p>-</p></td><td>
| |
− | <p>0,11835</p></td><td>
| |
− | <p>-</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>70</p></td><td>
| |
− | <p>-</p></td><td>
| |
− | <p>0,25843</p></td><td>
| |
− | <p>12</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>S0</p></td><td>
| |
− | <p>1:2</p></td><td>
| |
− | <p>0,38956</p></td><td>
| |
− | <p>8</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>90</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,48453</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>100</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,64187</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>7</p></td><td>
| |
− | <p>110</p></td><td>
| |
− | <p>1:3</p></td><td>
| |
− | <p>0,55917</p></td><td>
| |
− | <p>10</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Мы установили, что при температуре ниже 70 °С реакционная смесь характеризуется отсутствием максимумов поглощения в диапазонах длин волн 399-402 и 560-570 нм а также характерной сине-фиолетовой окраски. Наиболее высокие и стабильные значения оптической плотности наблюдаются при проведении реакции с температурным режимом 100 °С (за период 1-2 ч после начала реакции значение оптической плотности при длине волны 400 нм снизилось на 4 %). Проведение реакции выше 100 °С нецелесообразно т.к. образующийся продукт нестабилен во времени.
| |
− | | |
− | Таким образом, нами установлены оптимальные условия проведения реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и на этом основании предлагается следующая методика анализа: к 2,5 мл 0,2 % раствора а-аминокислоты добавляют 0,5 мл 0,2 % раствора нингидрина в ацетоне и нагревают при температуре 100 °С в течение 15 мин (для лизина продолжительность реакции составляет 3-5 мин, т.к. более длительное нагревание приводит к разложению продукта реакции). После полного охлаждения продукт реакции разбавляют водой очищенной и спустя 1 ч после начала реакции определяют значение оптической плотности в диапазонах длин волн 399-402 нм на спектрофотометре в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
| |
− | | |
− | Данные условия проведения реакции мы использовали для большинства а-аминокислот, однако цистеин и тирозин вследствие их низкой растворимости в воде использовали в концентрации 0,04 % растворов по 2,5 мл.
| |
− | | |
− | С целью выявления подчинения закону светопоглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне при длине волны 400 нм нами исследована зависимость светопоглощения от концентрации а-аминокислоты (рис. 9).
| |
− | [[Image:Ningidr9.jpg|250px|thumb|right|Рис 9. Калибровочный график продукта реакции метионина]]
| |
− | | |
− | На рис. 9 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия метионина с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне подчиняется закону светопоглощения при длине волны 400 нм в концентрациях от 0,005 до 0,02 мг/мл.
| |
− | | |
− | С целью установления аналитических возможностей оптимизированных условий нингидриновой реакции, нами проведен спектральный анализ раствора нингидрина в ацетоне после его нагревания при температуре 100 °С, без добавления раствора а-аминокислоты (табл. 5). Продукт реакции разбавляли водой до 100 мл.
| |
− | | |
− | '''Таблица 5. Спектральный анализ 0,2 % ацетонового раствора нингидрина'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td>
| |
− | <p>Диапазон длин волн, нм</p></td><td>
| |
− | <p>Значения оптической плотности</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>220-240</p></td><td>
| |
− | <p>0,88340-0,82691</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>240-270</p></td><td>
| |
− | <p>0,64921-0,59522</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>400-405</p></td><td>
| |
− | <p>0,17690-0,16592 .</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>560-570</p></td><td>
| |
− | <p>0,13250-0,1100</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Спектральный анализ показал, что раствор нингидрина в ацетоне имеет светопоглощение в тех же диапазонах длин волн, что и продукты его реакции с аминокислотами. Возможно, при нагревании происходит взаимодействие ацетона с нингидрином, и образуются продукты, которые поглощают в УФ- и видимой области спектров. Таким образом, ацетоновый раствор нингидрина может быть использован для количественного определения а-аминокислот только при условии сравнительного анализа спектральных данных продукта реакции анализируемой а-аминокислоты и раствора нингидрина, что существенно усложняет проведение анализа. Кроме того, ацетон является летучим, токсичным и пожароопасным растворителем, что ограничивает его использование.
| |
− | | |
− | На этом основании нами изучены продукты нингидриновой реакции в нелетучем растворителе - диметилсульфоксиде (ДМСО).
| |
− | | |
− | == Исследование реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в диметилсульфоксиде ==
| |
− | | |
− | В следующей серии экспериментов в качестве растворителя для нингидрина мы использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Растворы нингидрина в ДМСО часто используют для количественного определения аминокислот с помощью аминокислотных анализаторов [1]. Важно отметить, что ДМСО имеет преимущества по сравнению с ацетоном: данный растворитель нелетучий, имеет невысокую токсичность, взрыво- и пожаробезопасен, что обеспечивает удобство его использования.
| |
− | | |
− | В экспериментах, на основании ранее оптимизированных условий реакции, мы использовали 0,2 % раствор нингидрина в ДМСО.
| |
− | | |
− | Нами исследованы спектры поглощения продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО в диапазонах длин волн 220-600 нм. Реакцию проводили в течение 15 мин при температуре 100 °С по методике, которую мы оптимизировали для проведения реакции с раствором нингидрина в ацетоне (см. раздел 1.2.). После полного охлаждения продукты нингидриновой реакции каждой из 20-ти си-аминокислот разбавляли водой в различных соотношениях до получения значений оптической плотности максимумов поглощения от 0,4 до 1,0. Нами установлены три максимума поглощения при 250, 400 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 18-ти из 20-ти а-аминокислот. Исключение составили продукты нингидриновой реакции с триптофаном и пролином, что объясняется особенностями структуры данных а-аминокислот. Продукт нингидриновой реакции триптофана в УФ-области имеет максимум поглощения при 272 нм, в видимой области спектра максимумы поглощений аналогичны другим а-аминокислотам. Продукт реакции раствора нингидрина в ДМСО с пролином окрашен в жёлтый цвет и имеет два максимума поглощения при длинах волн 300 и 340 нм, в видимой области спектра максимумы поглощения отсутствуют, однако имеется четкое плечо в широком диапазоне длин волн 520-600 нм, с достаточно интенсивным поглощением. Важно отметить, что продукты реакции большинства а-аминокислот имеют единые максимумы поглощения при 250 нм и 400 нм.
| |
− | | |
− | По аналогии с ацетоновым раствором нингидрина, нами изучена зависимость светопоглощения продукта реакции с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО от концентрации а-аминокислоты при длине волны 400 нм и установлено её подчинение закону светопоглощения Бугера - Ламберта - Бера (рис. 10).
| |
− | [[Image:Ningidr10.jpg|250px|thumb|right|Рис 10. Калибровочный график продукта реакции глицина]]
| |
− | | |
− | На рис. 10 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт реакции глицина с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО при длине волны 400 нм подчиняется закону светопоглощения в концентрации глицина от 0,03 до 0,19 мг/мл.
| |
− | | |
− | Для выяснения аналитических возможностей реакции нами изучены спектральные характеристики 0,2 % раствора нингидрина в ДМСО в условиях ее проведения, где вместо раствора а-аминокислоты добавляли равное количество воды. После полного охлаждения продукт реакции разбавляли водой до 100 мл. (табл. 6).
| |
− | | |
− | '''Таблица 6. Спектральный анализ 0,2 % раствора нингидрина в ДМСО'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td>
| |
− | <p>Длина волны, нм</p></td><td>
| |
− | <p>Значение оптической плотности</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>250</p></td><td>
| |
− | <p>0,86921</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>400</p></td><td>
| |
− | <p>0,18491</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>560-570</p></td><td>
| |
− | <p>0,20470</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Спектральный анализ показал, что раствор нингидрина в ДМСО, также как и в ацетоне поглощает в тех же диапазонах, в которых имеют поглощение и продукты его реакции с а аминокислотами, что существенно усложняет проведение анализа.
| |
− | | |
− | == Исследование реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина ==
| |
− | | |
− | Для качественного и количественного анализа а-аминокислот достаточно часто используют водный раствор нингидрина [7, 13, 20]. На этом основании нами исследованы спектральные характеристики 0,2 % водного раствора нингидрина после его нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин и установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220-300 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм (рис. 11).
| |
− | [[Image:Ningidr11.jpg|250px|thumb|right|Рис 11. Спектр поглощения водного раствора нингидрина после нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин]]
| |
− | | |
− | Учитывая, что вода является наиболее доступным и безопасным растворителем, наиболее целесообразно проводить спектрофотометрическое исследование продуктов реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина в видимой области спектра в диапазоне длин волн - от 400 до 600 нм.
| |
− | | |
− | === Изучение спектральных характеристик продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина ===
| |
− | | |
− | Нами проведена нингидриновая реакция с 0,2 % водным раствором нингидрина по методике, указанной в ФСП на кислоту глутаминовую [10]. После полного охлаждения продукты нингидриновой реакции каждой из 20-ти а-аминокислот разбавляли водой в различных соотношениях до получения значений оптической плотности максимумов поглощения от 0,4 до 1,0. и изучали спектральные характеристики продуктов для 20-ти о-аминокислот в диапазоне длин волн 380-600 нм. Было установлено, что спектры поглощения имеют единый максимум при длине волны 400±2 нм и в диапазоне длин волн 550-560 нм.
| |
− | | |
− | Исключение составляют продукты реакции с цистеином, пролином и гистидином. Продукт реакции с цистеином характеризуется низкой интенсивностью поглощения в видимой области и имеет максимум при длине волны 450 нм. Пролин -единственная о-аминокислота, в структуре которой отсутствует первичная аминогруппа, этим объясняется отсутствие характерного (при 400 нм) максимума поглощения в видимой области спектра. Однако в диапазоне 395-402 нм отмечается четкое плечо с достаточно интенсивным поглощением. Продукт реакции с гистидином имеет недостаточную интенсивность поглощения в видимой области спектра. Важно отметить, что большинство продуктов реакции характеризуются единым максимумом поглощения при 400 нм (рис. 12-15).
| |
− | [[Image:Ningidr12.jpg|250px|thumb|right|Рис 12. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr13.jpg|250px|thumb|right|Рис 13. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот 0,2 % водным раствором нингидрина]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr14.jpg|250px|thumb|right|Рис 14. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина]]
| |
− | | |
− | [[Image:Ningidr15.jpg|250px|thumb|right|Рис 15. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина]]
| |
− | | |
− | Таким образом, наиболее целесообразно проводить реакцию с использованием водного раствора нингидрина с последующим определением оптической плотности её продукта при длине волны 400 нм.
| |
− | | |
− | === Оптимизация условий проведения реакции a-аминокислот с ОД % водным раствором нингидрина ===
| |
− | | |
− | Нами изучено влияние важнейших факторов (соотношение компонентов реакции, продолжительность и температурный режим) на стабильность и значение оптической плотности при длине волны 400 нм продуктов взаимодействия a-аминокислот с водным раствором нингидрина. Для анализа мы использовали глицин.
| |
− | | |
− | При проведении реакции в условиях, указанных в ФСП на кислоту глутаминовую [10], нами установлено, что продукт реакции характеризуется низкой стабильностью значения оптической плотности при длине волны 400 нм во времени.
| |
− | | |
− | Поэтому, мы провели оптимизацию количественных соотношений между компонентами. Реакцию проводили при температуре 100 °С в течение 15 мин.
| |
− | | |
− | Продукты, после полного охлаждения, разбавляли водой (табл. 7).
| |
− | | |
− | '''Таблица 7. Оптимизация количественных соотношений компонентов реакции'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td colspan="3">
| |
− | <p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td>
| |
− | <p>Разведени</p>
| |
− | <p>е</p></td><td colspan="2">
| |
− | <p>Оптическая плотность продукта при λ=400 нм</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p></p></td><td>
| |
− | <p>Навеска глицина, г</p></td><td>
| |
− | <p>Объем раствора глицина, мл</p></td><td>
| |
− | <p>Объем 0,2 % водного раствора нингидрина, мл</p></td><td>
| |
− | <p>продукта</p>
| |
− | <p>реакции</p>
| |
− | <p>водой</p></td><td>
| |
− | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
| |
− | <p>Снижение значения за период 1-2 ч после начала реакции, %</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>7</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>0,02</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>До 50 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,61047</p></td><td>
| |
− | <p>19</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>0,01</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,33356</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>0,005</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,34825</p></td><td>
| |
− | <p>11</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>0,0025</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,36545</p></td><td>
| |
− | <p>7</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,36835</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>0,0005</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 50 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,36156</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>7</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>1,25</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,33295</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>0,75</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,37382</p></td><td>
| |
− | <p>6</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>9</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>0,9</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,34526</p></td><td>
| |
− | <p>9</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1Д</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,38110</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>11</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1,2</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,38474</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>12</p></td><td>
| |
− | <p>0,001</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>1,3</p></td><td>
| |
− | <p>до 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,38557</p></td><td>
| |
− | <p>7</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Из данных таблицы видно, что наиболее стабильный продукт во времени наблюдается при проведении реакции между 1 мл 0,1 % раствором глицина и 1,1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина (значение оптической плотности за период времени 1-2 ч после начала реакции снижается на 1 %).
| |
− | | |
− | Нами также изучено влияние температуры, и продолжительности реакции во времени на стабильность продуктов (табл. 8).
| |
− | | |
− | '''Таблица 8. Оптимизация температурного режима и продолжительности реакции'''
| |
− | | |
− | <table cellpadding="7" border="1">
| |
− | <tr><td rowspan="2">
| |
− | <p>№ п/п</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Температурный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Продолжительность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2">
| |
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2">
| |
− | <p>Оптическая плотность продукта при λ=400 нм</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
| |
− | <p>Снижение значения за период 1-2 ч после начала реакции, %</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>1</p></td><td>
| |
− | <p>80</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,33638</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>2</p></td><td>
| |
− | <p>90</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,36167</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>3</p></td><td>
| |
− | <p>100</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,38110</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>4</p></td><td>
| |
− | <p>110</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,39667</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>5</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,41112</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>6</p></td><td>
| |
− | <p>130</p></td><td>
| |
− | <p>15</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,37312</p></td><td>
| |
− | <p>4</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>7</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>25</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,35289</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>22,5</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,43140</p></td><td>
| |
− | <p>2,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>9</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>20</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,45056</p></td><td>
| |
− | <p>0,5</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>17,5</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,43273</p></td><td>
| |
− | <p>1</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>11</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>12,5</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,40105</p></td><td>
| |
− | <p>3</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>8</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>10</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,38908</p></td><td>
| |
− | <p>2</p></td></tr>
| |
− | <tr><td>
| |
− | <p>9</p></td><td>
| |
− | <p>120</p></td><td>
| |
− | <p>7,5</p></td><td>
| |
− | <p>До 100 мл</p></td><td>
| |
− | <p>0,34934</p></td><td>
| |
− | <p>5</p></td></tr>
| |
− | </table>
| |
− | | |
− | Анализ данных таблицы показывает, что наиболее стабильные и высокие значения оптической плотности наблюдаются при проведении реакции в течение 20 мин при температуре 120 ^С. Следует отметить, что период времени 1-1,5 ч после начала реакции характеризуется максимальной стабильностью продукта: значение D остается постоянным с точностью до 0,001. При использовании растворов нингидрина в ацетоне и ДМСО стабильность продуктов реакции значительно ниже. Кроме того, как было описано выше, сам нингидрин в ацетоновом растворе и в растворе ДМСО имеет светопоглощение в тех же диапазонах, что и продукты его реакции с а-аминокислотами. Учитывая доступность и безопасность, вода является наиболее рациональным растворителем для приготовления нингидринового реактива.
| |
− | | |
− | С целью изучения возможности взаимодействия нингидрина с водой, нами изучены спектральные характеристики 0,2 % водного раствора нингидрина в оптимизированных условиях проведения нингидриновой реакции (при температуре 120 °С в течение 20 мин), однако вместо раствора а-аминокислоты мы добавили равное количество воды. Установлено, что исследуемый раствор не поглощает в диапазоне длин волн 350-600 нм, в то время как продукты реакции а-аминокислот с водным раствором нингидрина имеют четкий максимум поглощения именно при 400±2 нм, что позволяет использовать эту длину волны для количественной оценки а-аминокислот.
| |
− | | |
− | Таким образом, на примере глицина нами установлены оптимальные условия проведения нингидриновой реакции: к 1 мл 0,1 % раствора а-аминокислоты добавляют 1,1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения продукт реакции разбавляют водой до 100 мл и спустя 1 ч после начала реакции на спектрофотометре определяют значение оптической плотности при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
| |
− | | |
− | Нами установлено, что указанные выше условия проведения нингидриновой реакции являются наиболее оптимальными для большинства а-аминокислот.
| |
− | | |
− | Исключение составили следующие а-аминокислоты: цистеин, тирозин, аспарагиновая кислота и лизин. Цистеин и тирозин, вследствие их низкой растворимости в воде, мы использовали в виде менее концентрированных 0,04 % растворов, увеличив их объёмы до 2,5 мл. При этом 0,2 % водный раствор нингидрина добавляли в эквимолярных количествах по отношению к указанным о-аминокислотам: 0,7 мл - к 2,5 мл 0,04 % раствора цистеина и 0,5 мл - к 2,5 мл 0,04 % раствора тирозина.
| |
− | | |
− | Продукты реакции аспарагиновой кислоты и лизина с 0,2 % водным раствором нингидрина отличаются невысокими значениями оптической плотности при длине волны 400 нм. Аспарагиновая кислота — дикарбоновая а-аминокислота, лизин - а-аминокислота содержащая в радикале первичную аминогруппу. По-видимому, за счёт наличия в указанных аминокислотах дополнительных карбоксильной и аминогрупп изменяется pH реакционной среды, что приводит к частичному разложению продуктов реакции. На этом основании мы увеличили объёмы реагентов в 2 раза, т.е. по 2,2 мл 0,2 % водного раствора нингидрина добавляли к 2 мл 0,1 % растворам аспарагиновой кислоты и лизина. Кроме того, для лизина, вследствие нестойкости продукта его реакции с нингидрином, оптимальная продолжительность нагревания составляет 2 мин. Спектры продуктов взаимодействия нингидрина с данными а-аминокислотами снимают на спектрофотометре без предварительного разведения.
| |
− | | |
− | На основании оптимизированных условий проведения реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина нами была изучена зависимость светопоглощения продукта реакции от концентрации о-аминокислоты при длине волны 400 нм (рис. 16).
| |
− | [[Image:Ningidr16.jpg|250px|thumb|right|Рис 16. Калибровочный график продукта реакции глицина]]
| |
− | | |
− | На рис. 16 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия глицина с 0,2 % водным раствором нингидрина подчиняется закону светопоглощения в концентрации от 0,005 до 0,025 мг/мл.
| |
− | | |
− | == Заключение ==
| |
− | | |
− | Таким образом, на основании исследования спектральных характеристик продуктов реакции а-аминокислот с нингидрином в различных растворителях установлены единые максимумы поглощения для большинства а-аминокислот: в УФ- (в диапазоне длин волн 220-260 нм) и видимой областях спектра (при длине волны 400±2 нм, а также в диапазоне длин волн 560-570 нм).
| |
− | | |
− | Оптимизация условий проведения нингидриновой реакции показала, что продукты реакции а-аминокислот с водным раствором нингидрина характеризуются наибольшей стабильностью во времени и имеют единый максимум поглощения при длине волны 400±2 нм. Поэтому, наиболее целесообразно проводить нингидриновую реакцию с водным раствором нингидрина, с последующим спектрофотометрическим определением продуктов при длине волны 400 нм.
| |
− | | |
− | На этом основании разработаны методы количественного определения а-аминокислот в лекарственных препаратах и растительном сырье, основанные на реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина. Разработанные методы отличаются достаточной точностью (относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %) и доступностью.
| |
− | | |
− | == Читайте также ==
| |
− | | |
− | *[[Количественное определение глицина в таблетках]]
| |
− | *[[Количественное определение белка в продуктах]] | |
− | *[[Допинг-контроль: методы и тесты]]
| |
− | | |
− | == Список литературы ==
| |
− | | |
− | 1. Аминокислотный и минеральный состав надземной части Atragene Speciosa / И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Н.В. Барановская и др. // Хим.-фарм. журн. - 2002.
| |
− | | |
− | 2. Аникина Н.В. Спектрофотометрическое определение цистина / Н.В. Аникина, М.Е. Пудель // Хим.-фарм. журн. -1983. - Т. 17, №2.- С.244-245.
| |
− | | |
− | 3. Бондаренко Б.Н. Количественное определение аминокислот при хроматографии в тонком слое / Б.Н. Бондаренко // Лаб. дело. —1984. - №2. — С. 118-120.
| |
− | | |
− | 4. Бородина B.JI. Экспресс-метод количественного определения аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии / B.J1. Бородина, А.И. Крылов, В.А. Рогозкин // Лаб. дело. —1984.— №7. — С. 395—397.
| |
− | | |
− | 5. Великанова О.Ф. Спектрофотометрический метод определения суммарного количества аминокислот в сыворотке крови / О.Ф. Великанова, Ю.В. Галаев // Лаб. дело. - 1981. - № 11. - С. 701-702.
| |
− | | |
− | 6. Глицин таблетки сублингвальные 0,1 г.: ФСП 42-0025265-02-99. — 07.06.2002.
| |
− | | |
− | 7. Государственная фармакопея СССР. — XI - изд. — М.: Медицина, 1989. - Вып 2. -400 с.
| |
− | | |
− | 8. Доссон Р. Справочник биохимика / Р. Доссон, Д. Эллиот - М.: Мир, 1991. - 544 -С.
| |
− | | |
− | 9. Изучение аминокислотной фракции экстракта мумие сухого / ТЛ. Киселева, Л.Н. Фролова, ЛА. Баратова и др. // Хим.-фарм. журн. - 1998. - Т. 32, № 2. - С. 47-51.
| |
− | | |
− | 10. Кислота глютаминовая: ВФС 42-2722-96. - 25.04.96.
| |
− | | |
− | 11. Количественное определение аминокислот в пыльце (обножке) / И.В. Духанина,А.Ю. Айрапетова, Г.Д. Лазарян. и др. // Хим.-фарм. журн. - 2006. - Т. 40, № 2. -С. 22-23.
| |
− | | |
− | 12. Колориметрические методы анализа азотистых соединений: Метод, реком / Волгогр. сельхоз. ин-т, кафедра химии; Сост. В.А. Храмов. - Волгоград, 1979.- 15 с.
| |
− | | |
− | 13. Копытко Я.Ф. Аминокислоты и жирные кислоты настоек Парнасия (Белозора болотного) гомеопатических матричных / Я.Ф. Копытко // Хим.-фарм. журн. -2003. -Т. 37, № 7.
| |
− | | |
− | 14. Крищенко В.П. Комплексная методика определения аминокислот в различных фракциях азотного комплекса растений / В.П. Крищенко // Изв. АН СССР. Сер. Биология. - 1978. - № 3! - С. 327-331.
| |
− | | |
− | 15. Лазарян Д.С. Сравнительное изучение аминокислотного состава расплода пчел / Д.С. Лазарян // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 12. - С. 42-44.
| |
− | | |
− | 16. Мансурова И.Д. Определение количества оксилизина и лизина в сыворотке крови / Й.Д. Мансурова, Е.Н. Набиджанова // Лаб. дело. - 1982. - № 8. - С. 459-461.
| |
− | | |
− | 17. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермаковой. -Л : Химия, 1977.-540 с.
| |
− | | |
− | 18. Половодова Н.В. Разработка спектрофотометрической методики определения кислоты аспарагиновой на основе реакции с нингидрином / Н.В. Половодова // Молодежная наука Прикамье - 2002: Тез. докл. Обл. науч. конф. молодых ученых, студентов и аспирантов, Пермь, 6-9 декабря 2002 г. - Пермь, 2002.- С. 162.
| |
− | | |
− | 19. Россихина А.В. Разработка способа определения калия аспарагината в препарате «Аспаркам» / А.В. Россихина // Молодежная наука Прикамье - 2002: Тез. докл. Обл. науч. конф. молодых ученых, студентов и аспирантов, Пермь, 6-9 декабря 2002 г. - Пермь, 2002. - С. 163.
| |
− | | |
− | 20. Стандартизация рогов и пантов северного оленя. 1. Количественное определение нингидринактивных веществ в порошке рогов северного оленя /В.П. Пахомов, Т.В. Максимова, И.Н. Никулина и др. // Хим.-фарм. журн. - 1997. -Т. 31,№4.-С. 53-54.
| |
− | | |
− | 21. Тихонов Б.Б. Применение метода капиллярного электрофореза для исследования аминокислотного состава белков амаранта / Б.Б. Тихонов П Вестн. Тверск. гос. техн. ун-та. - 2002. - № 2. - С. 128-130.
| |
− | | |
− | 22. УФ-спектрофотометрическое определение ароматических аминокислот / Е.Р. Рошаль, В.Н. Сенаторова, А.Ф. Шолин и др. // Хим.-фарм. журн. - 1991. - Т. 25,№4.-С. 80-83.
| |
− | | |
− | 23. Химия биологически активных и природных соединений / Под ред. Н.А. Преображенского, Р.П. Евстигнеевой. - М.: Химия, 1970. - 512 с.
| |
− | | |
− | 24. Цистеин: ВФС 42-2633-96. - 20.02.96.
| |
− | | |
− | 25. Chen Bing. Одновременное определение аминокислот в пищевых продуктах методом капиллярного электрофореза при косвенном детектировании в УФ-лучах / Chen Bing , Li Xiaoge, He Ping // Chin. J. Chromatogr. - 2004. - VOL. 22, № 1.-P. 74-76.
| |
− | | |
− | 26. Fu Min. Определение следовых количеств аминокислот нейротрансмиттеров в плазме крови крыс методом капиллярного электрофореза в сочетании с детектированием флуоресценции, индуцированной диодным лазером / Fu Min, Zhang Dongming, Ma Wanyan // Chin. J. Anal. Chem. - 2003. - VOL. 31, № 3. - P. 296-299.
| |
− | | |
− | 27. Garcia-Willar N. Liquid chromatographic determination of lysine by potentiometric detection with biosensor / N. Garcia-Willar, Hemandes-Cassou // Anal. Lett. -2002.-№8.-P. 1313-1323.
| |
− | | |
− | 28. Gatte R. Phanquenone: a useful fluorescent pre-chromatographic derivatization reagent for liquid chromatographic analyses of aminoacid dosage form / R. Gatte, M.G. Gioia, A.M. Di Pieta // Anal. chem. acta. - 2002. - № 1-2. - P. 11-20.
| |
− | | |
− | 29. Khan A.A. Studies of the kinetics and mechanism of interaction of ot-aminoacids with ninhydrin // J. Indian Chem. Soc. - 1989. - VOL. 66, № 7. - P. 454-456.
| |
− | | |
− | 30. Kuryt T. Quantitative analysis of amino acids in biological fluids by gas chromatography with flame ionization detection / T. Kuryt, D. Sawnor-Corszynska // Acta chromatogr. - 2000. - № 10. - P. 97-103.
| |
− | | |
− | 31. Yu Hong. Определение аминокислот и глюкозы в аминокислотных инъекционных растворах методом анионообменной хроматографии с интегрированным импульсным амперометрическим детектированием
| |