Рисунок 5.1. Использование ретровирусного вектора. А. Схема получения ретровирусного вектора. Для получения не способных к репродукции ретровирусных векторов используют специальные линии клеток, способные синтезировать те вирусные белки, гены которых удалены при конструировании вектора. В клетки подходящей линии (например, эмбриональные клетки почки человека) с помощью бактериальных плазмид вводят гены gag (G), pol (Р) и env (Е). Клетки, синтезирующие соответствующие вирусные белки, называют упаковывающими. Затем плазмиду, содержащую рекомбинантную ДНК провируса, в которой вместо генов gag, pol и env находится нужный трансген, используют для трансфекции упаковывающих клеток. Теперь клетки содержат все, что нужно для сборки вирусов, и ретровирусные векторы начинают накапливаться в культуральной среде. Эти векторы содержат трансген, но лишены вирусных генов gag, pol и env, а потому при заражении следующей клетки они не могут репродуцироваться. Б. Экспрессия трансгена в клетке-мишени после внедрения РНК-содержащего ретровирусного вектора (см. «Жизненный цикл»).
== Клинические подходы ==
Введение нуклеиновых кислот в живые клетки можно применять во многих областях медицины. Первоначально генотерапию разрабатывали для лечения наследственных заболеваний, но в дальнейшем различные ее методы, включая использование лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот, были предложены и для лечения широкого круга приобретенных болезней, в том числе злокачественных новообразований и инфекций.
=== Генотерапия наследственных заболеваний ===
Генотерапию можно применить для лечения многих наследственных заболеваний, особенно аутосомно-рецессивных. В этих случаях мутация обычно препятствует синтезу нормального белка (мутация, вызывающая подавление функции). Для лечения необходимо доставить нормальный ген в пораженные ткани. Этот подход часто называют генной заменой, хотя в действительности мутантный ген не затрагивается. Поэтому более точный термин — генное усиление. Введение дополнительных копий нормального гена в пораженную ткань при доминантном наследовании заболевания часто не приводит к излечению, особенно при доминантно-негативных мутациях. Эти общие принципы генотерапии проиллюстрированы конкретными примерами, приведенными ниже.
Для преодоления наследственного дефекта трансген должен обеспечивать достаточный, хотя и неодинаковый при разных заболеваниях, уровень экспрессии. Этот уровень часто оценивают на основе сравнения тяжести заболевания со степенью генетического нарушения. Например, при гемофилии степень нарушения свертывания крови пропорциональна недостаточности факторов свертывания. В других случаях такие оценки невозможны. Не известно, например, какого уровня экспрессии гена CFTR (ген кодирует белок — регулятор мембранной проводимости) необходимо добиться для достижения лечебного эффекта при муковисцидозе. Еще сложнее случаи, когда требуется тонкая регуляция экспрессии. Примером могут быть талассемии — болезни, обусловленные нарушением синтеза а- или β-цепей глобина. Избыточная экспрессия трансгена, кодирующего одну из цепей, не менее опасна, чем само заболевание.
==== Корригирующая генотерапия ====
Для прямой коррекции генетических нарушений (а не просто добавления нормального аллеля) было разработано несколько подходов. Теоретически эти подходы обладают рядом преимуществ; например, одновременно снижается экспрессия мутантного гена и увеличивается вероятность естественной регуляции экспрессии трансгена. Корригирующая генотерапия хорошо подходит для лечения наследственных заболеваний, вызванных доминантно-негативными мутациями.
Первый подход заключается в исправлении мРНК с помощью каталитически активной РНК (рибозима), обеспечивающей транс-сплайсинг (см. ниже). При этом дефектный участок молекулы мРНК заменяется на соответствующий нормальный участок. Второй подход направлен на коррекцию нарушений на уровне генома, для чего применяют специальные РНК/ДНК-олигонуклеотиды. В обоих случаях регуляция экспрессии не нарушается.
'''Транс-сплайсинг с помощью рибозимов'''. С начала 1980-х гг., когда была открыта ферментативная активность РНК, рибозимы стали объектом пристального изучения. Многочисленные биохимические исследования были направлены на выяснение структуры активных центров рибозимов и механизмов катализа. Новый интерес к рибозимам вызван их возможным применением в генотерапии.
'''Рибозимы'''. Первой известной реакцией, катализируемой РНК, стал аутосплайсинг интрона (интрон группы I) в молекуле рРНК простейшего Tetrahymena thermophila. Эта реакция была подробно изучена, а механизм, посредством которого рРНК вырезает себя из молекулы-предшественника, хорошо известен (Cech, 1993). Затем была открыта РНК-содержащая субъединица рибонуклеазы Р. Этот фермент катализирует удаление 5'-концевой последовательности при созревании тРНК во многих клетках (Symons, 1992). Вторая группа (группа II) интронов, обладающих каталитической активностью, была обнаружена в геноме органелл некоторых низших организмов (Frank and Расе, 1998). Эти интроны не только катализируют аутосплайсинг, но и способны встраиваться в двухцепочечную ДНК с помощью многофункционального белка, кодируемого интроном. Обнаружена каталитическая активность и некоторых других последовательностей РНК, присутствующих в возбудителях болезней растений и животных. Молоткообразные и шпилькообразные рибозимы обнаружены в РНК вироидов и вирусоидов растений. Рибозим обнаружен и в короткой одноцепочечной РНК вируса гепатита D, выделенного от некоторых больных гепатитом В. Каждый из этих небольших рибозимов катализирует реакцию саморасщепления, которая, по-видимому, играет важную роль в репликации одноцепочечных РНК указанных возбудителей (Symons, 1992).
Рибозимы различаются по размеру и механизму катализа. Каждый тип рибозима имеет характерную вторичную и третичную структуру, необходимую для формирования активного центра и осуществления катализа (Cech, 1992). Такие рибозимы, как интроны группы I или субъединица рибонуклеазы Р, обычно содержат более 200 нуклеотидов и расщепляют РНК с образованием З'-гидроксильной и 5'-фосфатной групп. Напротив, молоткообразные и шпилькообразные рибозимы, а также рибозим вируса гепатита D обычно содержат лишь 30—80 нуклеотидов и расщепляют РНК с образованием 2',3’-циклофосфнт-ной и 5'-гидроксильной групп.
Все эти рибозимы были модифицированы таким образом, чтобы они могли расщеплять определенные последовательности других молекул РНК. Предполагается, что их можно будет применять для специфического подавления экспрессии генов (Rossi, 1999). Кроме того, способность к транс-сплайсингу, возможно, удастся использовать для коррекции дефектных транс-криптов путем замены мутантного участка на нормальную последовательность (рис. 5.4) (Sullenger, 1999).
Коррекцию молекул РНК с помощью рибозимов можно использовать для лечения различных заболеваний. Как уже описано выше, интрон группы I из Tetrahymena thermophila катализирует аутосплайсинг рРНК. Этот рибозим модифицировали так, чтобы он мог путем адресного транс-сплайсинга исправлять укороченные транскрипты lacZв Escherichia coli (Sullenger and Cech, 1994) и в клетках млекопитающих (Jones et al., 1996). В обоих случаях рибозимы с большой точностью вставляли нормальную последовательность в дефектный транскрипт, обеспечивая открытую рамку считывания. В дальнейших исследованиях определяли эффективность коррекции РНК: рибозимы исправляли до 50% укороченных транскриптов lacZ в фибробластах млекопитающих, в которые вводили плазмиды, кодирующие рибозим и исходный транскрипт lacZ (Jones and Sullenger, 1997).
Рисунок 5.4. Исправление и расщепление мРН К с помощью рибозимов. А. Исправление путем транс-сплайсинга. Мутация (замена нуклеотида) в мРН К обозначена Хм, а соответствующий нуклеотид в нормальном экзоне — Хн. Реакция начинается со спаривания комплементарных нуклеотидов между рибозимом (относится к интронам группы I) и м РН К. Затем рибозим катализирует расщепление мРН К и встраивание нормального участка экзона вместо мутантного. Б. Расщепление мРН К с помощью молоткообразного рибозима. Сначала происходит спаривание комплементарных нуклеотидов рибозима и мРНК, а затем расщепление мРНК у неспаренного нуклеотида между двухцепочечными участками I и III. Потом рибозим освобождается и может катализировать следующую реакцию расщепления. ДЦ — двухцепочечный участок.
Было показано, что рибозимы этой группы способны успешно исправлять дефектные транскрипты при распространенных наследственных заболеваниях и злокачественных новообразованиях. Успешный транс-сплайсинг получен для транскриптов, связанных с атрофической миотонией (Phylactou et al., 1998) и серповидноклеточной анемией (Lan etal., 1998), а также для дефектных транскриптов гена ТР53 (Watanabe and Sullenger, 2000).
'''РНК/ДНК-олигонуклеотнды (химеропластика)'''. Мутации, вызывающие заболевания, можно удалить, активировав клеточную систему репарации ДНК. Химерные РНК/ ДНК-олигонуклеотиды были успешно применены для замены мутантных последовательностей в геноме экспериментальных животных. Этот новый метод генотерапии, называемый химеропластикой, был разработан на основании данных, полученных при изучении гомологичной рекомбинации (Yoon et al., 1996). РНК/ДНК-олигонуклеотиды содержат самокомплементарные последовательности из дезоксирибонуклеотидов и модифицированных рибонуклеотидов (2'-0-метилрибонуклеотидов), образующие дуплексную структуру с двумя концевыми «шпильками» и петлями из политимидина (рис. 5.5). Наличие 2'-0-метилрибонуклеотидов обеспечивает повышенное сродство к последовательностям-мишеням и устойчивость к нуклеазам.
''Структура РНК/ДНК-олигонуклеотидов''. Обычно распознающая последовательность РНК/ДНК-олигонуклеотидов состоит из двух участков по десять модифицированных рибонуклеотидов и каждом, разделенных пятью дезоксирибонуклеотидами, причем центральный дезоксирибонуклеотид не комплементарен дезоксирибонуклеотиду мутантного участка генома (рис. 5.5). В точке некомплементарности олигонуклеотид служит матрицей для клеточной системы репарации ДНК, восстанавливающей нормальную последовательность. РНК/ДНК-олигонуклеотиды могут также обеспечивать делецию или вставку одного нуклеотида. Обычно длина распознающей последовательности составляет 25 нуклеотидов, но увеличение длины этого участка повышает вероятность коррекции (Gamper et al., 2000).
''Механизм действия''. Механизм действия РНК/ДНК-олигонуклеотидов до конца не изучен, однако уже получено много данных с использованием бесклеточного экстракта тканей человека (Cole-Strauss et al., 1999; Gamper et al., 2000). Адресное исправление последовательности требует участия двух клеточных механизмов: гомологичной рекомбинации и репарации неспаренных нуклеотидов. Исследования показывают, что промежуточным продуктом реакции является D-петля, в которой РНК/ ДНК-олигонуклеотид связан с комплементарными участками обеих цепей ДНК (рис. 5.5). В ранних исследованиях по химе-ропластике применяли РНК/ДНК-олигонуклеотиды, в которых обе комплементарные цепи шпилечной структуры несли необходимый для замены нуклеотид. В настоящее время считают, что химерная цепь нужна лишь для избирательного и прочного взаимодействия с нужной последовательностью и только ДНК-цепь служит матрицей для замены неспаренного нуклеотида, поэтому только эта цепь должна нести соответствующий нуклеотид. Считается также, что активность молекулы увеличивается, если одна из цепей состоит только из рибонуклеотидов, а не из чередующихся участков РНК/ДНК.
Вначале РНК/ДНК-олигонуклеотиды применяли для адресного изменения внехромосомной ДНК плазмид. Позже было показано, что с их помощью можно исправить последовательность и в геноме культивируемых клеток. В экспериментах in vitro использовали аллель, кодирующий гемоглобин S в культуре лимфобластов, мутантный ген щелочной фосфатазы в линии клеток НиН-7 и ген тирозиназы в меланоцитах мышей-альбиносов (Alexeev andYoon, 1998; Cole-Strauss etal., 1996; Kren etal., 1997).
Рисунок 5.5. Химеропластика. А. Структура химерного РНК/ ДНК-олигонуклеотида. Верхняя цепь химерного олигонуклеотида (верхний олигонуклеотид) содержит гомологичный участок (комплементарный последовательности-мишени), который состоит из двух последовательностей 2'-0-метилрибонуклеотидов (изображены белым), разделенных пятью дезоксирибонуклеотидами. Нижняя цепь полностью образована дезоксирибонуклеотидами. Один из дезоксирибонуклеотидов не комплементарен последовательности-мишени (показан стрелкой). Пары гуанин—цитозин, стабилизирующие структуру концевых «шпилек», и петли из политимидина (Т-петли) препятствуют соединению нескольких олигонуклеотидов с образованием конкатемерных молекул. Позднее были сконструированы химерные РН К/ДН К-олигонуклеотиды (нижний олигонуклеотид), где одна цепь полностью состояла из 2’-0-метилрибонуклеотидов и только в другой был некомплементарный нуклеотид, необходимый для исправления после-довательности-мишени. Б. Предполагаемый механизм исправления последовательности ДНК с помощью химерного РНК/ ДН К-олигонуклеотида. Верхний участок олигонуклеотида (черный) прочно связывает его с последовательностью-мишенью. Нижний участок (серый) служит матрицей для замены нуклеотида в геноме с помощью клеточного механизма репарации неспаренных нуклеотидов. Г — гуанин, Ц — цитозин.
Коррекция гена in vivo была впервые получена на крысах линии Gunn (модель синдрома Криглера—Найяра 1 типа), имеющих мутацию со сдвигом рамки в гене глю-куронилтрансферазы. При этой мутации глюкоуронил-трансферазная активность отсутствует и наблюдается гипербилирубинемия (Krenetal., 1999). РНК/ДНК-олиго-нуклеотид был сконструирован так, чтобы обеспечить адресную вставку утерянного нуклеотида в геномную ДНК. Этот олигонуклеотид вводили крысам в/в в виде комплекса с лактозилированным полиэтиленимином или внутри анионных липосом, после чего он попадал в печень. В 20% случаев происходила репарация гена, а транскрибируемая с него мРНК обеспечивала синтез активного фермента. Концентрация билирубина снижалась на 25% после введения первой дозы и на 50% исходного уровня после второй, что свидетельствует об аддитивном действии дробного введения РНК/ДНК-олигонуклеоти-да. Восстановление активности фермента было подтверждено биохимически, причем лечебное действие сохранялось не менее 6 мес.
В других исследованиях с помощью химеропластики успешно исправляли мутации генов дистрофина у мышей и золотистых ретриверов (две модели миопатии Дю-шенна), а также гена тирозиназы у мышей-альбиносов линии BALB/c (Alexeev et al., 2000; Bartlett et al., 2000b; Rando et al., 2000).
Для применения химеропластики в клинике предстоит выработать оптимальный способ доставки РНК/ДНК-олигонуклеотидов, а также дешевые и эффективные методы их синтеза и очистки (Yeetal., 1998). В большинстве способов доставки используют заряженные липосомы и синтетические полимеры, в том числе полиэтиленимин и полилизин. Наибольшую сложность вызывает доставка РНК/ДНК-олигонуклеотидов в ядро. Из-за длины (обычно 68 нуклеотидов) и очень стабильной вторичной структуры РНК/ДНК-олигонуклеотидов их синтез и очистка в достаточных количествах — сложный и дорогой процесс. Побочные продукты синтеза олигонуклеотидов токсичны, а не полностью синтезированные олигонуклеотиды могут конкурировать с конечным продуктом за места связывания на ДНК. Чаще всего для очистки РНК/ДНК-олигонуклеотидов применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию и электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
=== Методы инактивации генов ===
Важным приемом генотерапии многих приобретенных заболеваний, включая вирусные инфекции и злокачественные новообразования, стала адресная инактивация генов. Для этого используют антисмысловые олигонуклеотиды и некоторые типы рибозимов. Специфический антисмысловой олигонуклеотид для лечения цитомега-ловирусного ретинита — фомивирсен — первое лекарственное средство на основе нуклеиновой кислоты, одобренное ФДА.
==== Антисмысловые олигонуклеотиды ====
Синтетические короткие одноцепочечные молекулы ДНК, комплементарные мРНК, способны блокировать экспрессию определенных генов на уровне трансляции (Galderisi et al.. 1999; Ма et al., 2000). Антисмысловым олигонуклеотидам первого поколения устойчивость к действию нукпеаз придавали фосфоротиоатные связи, отличавшиеся от обычных фос-фодиэфирных связей между нуклеотидами тем, что один из боковых кислородов фосфатной группы заменен на серу (см. ниже). Антисмысловые олигонуклеотиды второго поколения имеют другие межнуклеотидные связи, а кроме того, они построены как из дезоксирибонуклеотидов, так и из модифицированных рибонуклеотидов. Новейшие антисмысловые олигонуклеотиды имеют улучшенные фармакокинетические характеристики и более безопасны, поскольку их неспецифическое действие подавлено (Agrawal and Kandimalla, 2000).
'''Механизм действия'''. Антисмысловые олигонуклеотиды обладают специфическим и неспецифическим действием (Galderisi et al., 1999; Ма etal., 2000). В основе специфического действия лежит взаимодействие с комплементарной последовательностью мРНК в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов, открытых Уотсоном и Криком. Это взаимодействие прекращает трансляцию мРНК на рибосомах и активирует рибонуклеазу Н — фермент, расщепляющий РНК в дуплексе РНК/ДНК. Обычно антисмысловой олигонуклеотид имеет длину 15—20 нуклеотидов, что достаточно для высокоспецифичного распознавания последовательности-мишени. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды обладают неспецифическим действием, которое не зависит от нуклеотидной последовательности. Олигонуклеотиды представляют собой полианионы, поэтому они могут связываться с различными белками, активировать комплемент или угнетать свертывающую систему крови. Последний эффект может привести к изменению показателей коагулограммы (Sheehan and Lan, 1998). Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие определенные последовательности (например, динуклеотиды цитозин—гуанозин или гуанозиновые триплеты), могут вызвать мощный иммунный ответ, включая активацию В-лимфоцитов и образование цитокинов — интерлейкинов, интерферона у, ФНОа и пр. (Pisetsky,1999).
'''Фармакокинетика'''. В первых клинических испытаниях, в которых антисмысловые олигонуклеотиды вводили в/в или п/к, обычно отмечали дозозависимое увеличение их стационарной сывороточной концентрации (Levin, 1999). Фармакокинетика обычно не зависит от последовательности нуклеотидов и длины олигонуклеотида. Элиминация после в/в введения осуществляется в пределах 24 ч, главным образом путем почечной экскреции. У экспериментальных животных антисмысловые олигонуклеотиды можно обнаружить в большинстве тканей (кроме мозга) в течение 48 ч. После внутриглазного введения Т| п больше (de Smet et al., 1999).
'''Фомивирсен'''. Антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны в первую очередь как противовирусные и противоопухолевые средства. Первое лекарственное средство, одобренное ФДА, — фомивирсен — представляет собой фосфоротиоатный олигонуклеотид из 21 пары нуклеотидов, комплементарный мРНК сверхранних генов цитомегаловируса человека (Nichols and Boeckh, 2000; Perry and Balfour, 1999). Он предназначен для местного лечения цитомегаловирусного ретинита у больных СПИДом. При выраженном, не поддающемся лечению ретините и угрозе потери зрения еженедельные инъекции фомивирсена в стекловидное тело значительно замедляют развитие заболевания. Побочное действие включает повышение внутриглазного давления и слабое или умеренное воспаление. Оба эффекта преходящи и легко поддаются местному лечению глюкокортикоидами.
'''Другие антисмысловые нуклеотиды'''. Некоторые другие антисмысловые олигонуклеотиды, предназначенные для лечения различных гемобластозов и злокачественных новообразований, находятся на ранней стадии клинических испытаний (Cotter, 1999; Yuen and Sikic, 2000). При хроническом миелолейкозе могут помочь антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные мРНК химерного онкогена BCR-ABL7. Другие олигонуклеотиды предназначены для подавления экспрессии гена BCL2, который кодирует белок, препятствующий апоптозу и, возможно, играющий важную роль в развитии лимфопро-лиферативных новообразований. Кроме того, мишенями для генотерапии могут быть мРНК, кодирующие протеинкиназы (Raf-1, протеинкиназу С), факторы транскрипции кроветворных клеток (Муb) и другие белки, участвующие в трансформации клеток (Ras, р53). Первые результаты клинических испытаний показывают, что соответствующие антисмысловые олигонуклеотиды хорошо переносятся и высокоэффективны.
==== Расщепляющие рибозимы ====
Некоторые искусственно полученные рибозимы способны избирательно расщеплять определенные последовательности РНК in vitro (James and Gibson, 1998; Kijima et al., 1995). В большинстве экспериментов использовали молоткообразные или шпилькообразные рибозимы; они значительно меньше рибозимов, полученных на основе интронов группы I. Рибозимы можно сконструировать таким образом, что они будут связываться с определенной последовательностью РНК и расщеплять ее, инактивируя тем самым РНК-мишень (рис. 5.4). Этот способ инактивации генов был использован в экспериментах по лечению вирусных инфекций (в том числе ВИЧ-инфекции и гепатита В; Меп-keand Hobom, 1997; Wands etal., 1997) и злокачественных новообразований, вызываемых экспрессией онкогенов (Irie et al., 1997). Расщепляющие рибозимы теоретически имеют два преимущества перед другими способами подавления мРНК: 1) расщепление приводит к прямой и необратимой инактивации РНК-мишени и 2) один рибозим расщепляет много молекул РНК, поэтому относительно небольшое количество рибозима способно подавить экспрессию гена.
Использование рибозимов против ВИЧ. Рибозимы способны расщеплять вирусную РНК на нескольких стадиях жизненного цикла вируса. Теоретически мишенями могут быть геномная РНК вируса на стадии заражения клетки, ранние вирусные мРНК, поздние вирусные мРНК и полноразмерные геномные РНК на стадии образования нуклеокапсида. На первый взгляд, расщепление вирусной РНК при проникновении вируса в клетку — наиболее эффективный метод, однако следует учитывать, что нуклеокапсид защищает вирусную РНК от рибозимов. Поэтому наиболее перспективным методом борьбы с ВИЧ-инфекцией считается расщепление ранних вирусных мРНК. Особенно подходят для этой цели молоткообразные и шпилькообразные рибозимы, поскольку они имеют небольшие размеры, простую вторичную структуру и им легко придать специфичность к РНК-мишени.
В нескольких работах показано, что рибозимы могут подавить репродукцию ВИЧ в культуре клеток при заражении последних очень малым количеством вирусов. В первой работе использовали молоткообразный рибозим, расщепляющий in vitro транскрипты гена gag. В культуре Т-лимфоцитов человека этот рибозим подавлял репродукцию ВИЧ (Sarveret al., 1990). Позже были получены рибозимы, специфичные ко многим консервативным последовательностям генома ВИЧ и подавлявшие (в разной степени) репродукцию ВИЧ в разных клеточных культурах. Более того, некоторые рибозимы в первичной культуре Т-лимфоцитов подавляли репродукцию вирусов различных штаммов, включая штаммы, выделенные от бальных (Poeschla and Wong-Staal, 1994). Сравнение каталитически активных и неактивных форм этих рибозимов показывает, что первые более эффективны против ВИЧ. Значит, подавление вирусной репродукции связано с каталитической активностью, а не только с действием антисмысловой последовательности рибозимов.
Чтобы оценить противовирусную активность рибозимов в условиях, более близких к клиническим, с помощью трансфекции модифицировали лимфоциты из крови человека так, что они начинали синтезировать шпилькообразный рибозим, специфичный к участку U5 генома ВИЧ. Такие клетки были устойчивы к заражению как искусственно полученными клонами ВИЧ, так и штаммами, выделенными от больных (Leavitt et al., 1994). Позже было показано, что макрофагоподобные клетки (полученные из стволовых кроветворных клеток пуповинной крови плода), которые синтезировали шпилькообразный рибозим, специфичный к 5'-концевому участку генома ВИЧ, были устойчивы к заражению вирусом, тропным к макрофагам (Yu et al.,1995). Трансфекция стволовых кроветворных клеток — перспективный путь получения клеток, устойчивых к ВИЧ. Такие стволовые клетки дифференцируются в лимфоциты и макрофаги — клетки, наиболее подверженные ВИЧ-инфекции. Начались клинические испытания безопасности и эффективности этого метода лечения ВИЧ-инфекции (Wong-Staal et al., 1998). Подавление экспрессии онкогенов с помощью рибозимов. Злокачественная трансформация часто обусловлена экспрессией мутантных онкогенов. Способность рибозимов избирательно подавлять экспрессию генов может быть использована для создания противоопухолевых средств. Например, молоткообразные рибозимы снижают степень злокачественности различных опухолевых клеток, содержащих активные гены RAS(Scharovsky et al., 2000) и химерный ген BCR-ABL1, характерный для хронического миелолейкоза (James and Gibson, 1998). В экспериментах in vitro показано, что транскрипт химерного гена BCR-ABL1 длиной 8500 нуклеотидов успешно расщепляется молоткообразным рибозимом, специфичным к месту слияния генов (James et al., 1996). В клеточных линиях, полученных при бластном кризе хронического миелолейкоза, экспрессия рибозима, специфичного к транскрипту химерного гена BCR-ABL1, снижает уровень соответствующей мРН К и белкa p210BCRABLI и подавляет пролиферацию клеток (Shore et al., 1993). Сходные результаты были получены при использовании рибозима той же специфичности, но полученного на основе субъединицы рибонук-леазы Р (Cobaleda and Sanchez-Garcia, 2000).
Инсерционная инактивация гена с помощью интронов группы II. Недавнее исследование показало, что с помощью интронов группы II можно также избирательно инактивировать гены (Guoet al., 2000). Модифицированный интрон группы II обладал избирательностью к двум мишеням, важным для ВИЧ-инфекции, — к гену CCR5, кодирующему рецептор Р-хемокинов, и к ДНК провируса. В человеческих клетках транскрибируемые последовательности обоих генов можно разорвать, встроив в них интрон. Эти данные носят предварительный характер, но тем не менее они открывают возможность нового подхода в генотерапии.
== Генотерапия отдельных заболеваний ==
В этом разделе описано применение генотерапии для лечения различных наследственных заболеваний иммунной системы, крови, печени, легких и скелетных мышц. Здесь упомянуты далеко не все болезни, для которых разрабатываются методы генотерапии. Обсуждаемые вопросы призваны проиллюстрировать основные методы и проблемы генотерапии.
=== Врожденные иммунодефициты ===
Генотерапия врожденных иммунодефицитов основана на трансфекции стволовых кроветворных клеток ex vivo. Сейчас проводят экспериментальные и клинические исследования методов лечения трех врожденных иммунодефицитов: недостаточности аденозиндезаминазы, Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита и хронической гранулематозной болезни. Эффективность генотерапии этих заболеваний пока ограничена из-за низкого уровня трансфекции. Впрочем, в недавнем исследовании удалось повысить уровень трансфекции ретровирусного вектора при Х-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците с помощью новых способов культивирования клеток (Cavazzana-Calvo et al., 2000).
'''Недостаточность аденозиндезаминазы'''. Первое наследственное заболевание, для лечения которого была применена генотерапия, — это недостаточность аденозиндезаминазы (Parkman et al., 2000). Отсутствие этого фермента ведет к накоплению токсичного для лимфоцитов дезокси-АТФ. Вследствие поражения гуморального и клеточного иммунитета у больных возникают частые тяжелые инфекции. Обычный метод лечения заключается в трансплантации костного мозга и периодическом в/в введении рекомбинантного фермента, конъюгированного с полиэтиленгликолем. В первом клиническом испытании двум больным ввели их собственные Т-лимфоциты после трансфекции ретровирусным вектором, содержавшим ген аденозиндезаминазы человека (Blaese et al., 1995).
У одного из этих больных длительное время сохранялись модифицированные Т-лимфоциты, а у другого эффект был незначительный. Первый больной живет нормальной жизнью уже несколько лет после лечения, симптоматика у него ослаблена (Anderson, 2000).
Исходя из тех соображений, что зрелые Т-лимфоциты не могут восстановить функцию иммунной системы в полном объеме, в последующих клинических испытаниях применяли трансфекцию ex vivo стволовых кроветворных клеток. Такие клетки способны дифференцироваться в любые клетки крови. К сожалению, в большинстве случаев эффективность трансфекции стволовых кроветворных клеток, полученных из костного мозга, периферической крови или крови пуповины, невелика (Halene and Kohn,2000). Кроме того, трансгены, введенные с помощью ретровирусных векторов, малоактивны в покоящихся, неделяшихся Т-лимфоцитах (Parkman et al., 2000). Возможно, с помощью лентивирусных векторов удастся повысить эффективность трансфекции (Case etal., 1999), но существуют сомнения в их безопасности.
'''Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит'''. При наиболее распространенной форме тяжелого комбинированного иммунодефицита мутация гена, расположенного на Х-хромосоме и кодирующего общую у-субъединицу (ус) рецепторов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-15, приводит к нарушению дифференцировки лимфоцитов и смертельному нарушению иммунитета. Как и при недостаточности аденозиндезаминазы, перспективной считается генотерапия с использованием стволовых кроветворных клеток. В недавнем исследовании в стволовые кроветворные клетки с помощью ретровирусного вектора ex vivo вводили нормальный ген ус-субъединицы, а клетки затем вводили двум детям с Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Cavazzana-Calvo et al., 2000). Через 10 мес у обоих детей было нормальное число Т-лимфоцитов, а функция лимфоцитов крови свидетельствовала об экспрессии в них ус-субъединицы. Успех этой работы объясняется изменением условий содержания клеток в культуре: на поверхность среды наносили фрагменты фибронектина и добавляли особую смесь цитокинов (фактор стволовых клеток, фактор дифференцировки мегакариоцитов, цито-кин FL). Цитокины стимулировали деление стволовых клеток и способствовали их заражению ретровирусами, а фибронектин увеличивал эффективность трансфекции, облегчая взаимодействие клетки с вирусом.
'''Хроническая гранулематозная болезнь'''. Это заболевание возникает в результате генетических дефектов, нарушающих функцию цитохрома Ь558 или НАДФН-оксидазы. Эти ферменты участвуют в выработке супероксидных радикалов в фагоцитах, а их недостаточность приводит к угрожающему жизни ослаблению иммунитета к бактериальным и грибковым инфекциям. По-видимому, для клинического улучшения достаточно ввести нормальный ген лишь в небольшую часть фагоцитов крови, так как при Х-сцепленной форме болезни у здоровых женщин-носителей всего 5% нейтрофилов имеют активную НАДФН-оксидазу. Для лечения обычно применяют аллотрансплантацию костного мозга, хотя генотерапия теоретически имеет много преимуществ. В проводимых сейчас исследованиях мишенями генотерапии служат гены CYBB, кодирующий (3-субъединицу цитохрома Ь558, и NCF1, кодирующий белок-активатор НАДФН-оксидазы (Kume and Dinauer, 2000). В клинических испытаниях, проведенных на пяти больных с дефицитом белка-активатора НАДФН-оксидазы, в/в введение стволовых клеток, в которые ex vivo с помощью ретровирусного вектора был введен ген NCF1, приводило к появлению полноценных гранулоцитов (Malech et al., 1997). Эти гранулоциты находились в крови в течение 6 мес после введения, хотя их количество было недостаточно для клинического улучшения. Для успешного лечения необходимо увеличить эффективность трансфекции стволовых клеток и продолжительность лечебного действия.
=== Болезни печени ===
Принципы генотерапии разработаны для различных нарушений обмена веществ, инфекций и злокачественных новообразований, поражающих печень. Задачу облетает существование многочисленных методов доставки генов в клетки печени. Для этого используют молекулярные конъюгаты, аденовирусные и ретровирусные векторы, липосомы (Shetty et al.. 2000). Для трансфекции in vivo применяют следующие пути введения трансгенов: непосредственно в печень, в/в или в желчные пути. Для трансфекции ex vivo проводят резекцию печени, выделяют гепатоциты, вводят в них трансгсны и модифицированные клетки трансплантируют обратно в печень.
Избирательность доставки трансгенов в печень может быть обеспечена специфическими рецепторами гепатоцитов, способными инициировать эндоцитоз (Smith and Wu, 1999). Так, в одних экспериментах лиганды, распознаваемые рецепторами асиалогликопротеидов, присоединяли к полимеру (например, полилизину) или к компонентам липосом, то есть к носителям, способным образовать комплекс с ДНК. В других — модифицировали белки внешней оболочки ретровирусных векторов, например, включали в них участок фактора роста гепатоцитов (Nguyen et al., 1998). Некоторые вирусные векторы имеют естественную тропность к клеткам печени. Приблизительно 90% аденовирусных векторов, введенных в/в, быстро поглощаются печенью. В этом процессе, по-видимому, участвуют концевые домены (головки) нитей аденовирусов (рис. 5.2) (Zinn et al., 1998).
'''Семейная гиперхолестеринемия (гиперлипопротеидемия типа II)'''. При этом заболевании снижается количество рецепторов ЛПНП или нарушается их функция. В результате печень теряет способность захватывать из крови ЛПНП, поэтому в плазме значительно повышается уровень холестерина, и уже в молодом возрасте развивается атеросклероз (гл. 36). Лекарственные средства при этой болезни малоэффективны, но после трансплантации печени содержание липидов в крови нормализуется, а развитие атеросклероза замедляется. Если методами генотерапии удастся восстановить синтез рецепторов ЛПНП в печени, то можно ожидать аналогичного лечебного эффекта. В экспериментах на кроликах с наследственной гиперлипопротеидемией (линия Ватанабе), которые представляют собой идеальную модель семейной гиперхолестеринемии, показано, что генотерапия ведет к стойкому снижению концентрации ЛПНП в сыворотке (Chowdhury et al., 1991). Сейчас проходят клинические испытания, в которых нескольким больным были трансплантированы их собственные генетически модифицированные гепатоциты. Гепатоциты получали после резекции печени, а затем ex vivo с помощью ретровирусного вектора в них вводили ген рецептора ЛПНП (Chowdhury et al.,1991). В этом исследовании показана принципиальная возможность, безопасность и эффективность генотерапии при поражении печени.
'''Гемофилия А'''. Наследственный дефицит фактора VIII многократно повышает риск тяжелых, опасных для жизни кровотечений. Обычно лечение заключается в частом введении препаратов фактора VIII, что помимо неудобства сопряжено с риском инфекции. Гемофилия А хорошо подходит для генотерапии, поскольку в широком диапазоне концентраций фактор VIII не оказывает побочного действия, алечебное действие наблюдается даже при концентрации, составляющей 5% нормальной (Кау and High, 1999). Попытки вызвать эктопический синтез фактора VIII (в отличие от фактора IX) не имели большого успеха. Неудачу объяснили тем, что полная длина колирующего участка гена фактора VIII составляет 7000 нуклеотидов, поэтому для трансфекции можно использовать только ретровирусные и аденовирусные векторы (Ваlague et al., 2000; VandenDriessche et al., 1999). Однако оказалось возможным создать аденоассоциированный вектор, содержащий укороченный ген фактора VI11 (Chao et al., 2000). Длина такого гена (4400 нуклеотидов) позволяет легко встроить его в аденоассоциированный вектор, а укороченный (лишенный домена В) фактор VIII полностью сохраняет свою активность.
С помощью различных вирусных векторов удалось получить длительную экспрессию фактора VIII в печени экспериментальных животных (Kaufman, 1999). Вектор вводили в/в, хотя при этом может происходить трансфекция клеток и других органов, таких, как селезенка и легкие. В некоторых работах использовали трансфекцию сх vivo. В стволовые кроветворные клетки из костного мозга человека с помощью ретровирусного вектора вводили ген фактора VIII, а затем эти клетки трансплантировали в селезенку мышей с иммунодефицитом (Chuah et al., 2000). После приживления клеток концентрация фактора VIII в крови мышей значительно увеличивалась, но экспрессия трансгена была непродолжительной.
Основная проблема в генотерапии гемофилии — возможность выработки антител против чужеродных для организма факторов, кодируемых трансгеном. Выработка антител обычно происходит и при введении препаратов факторов VIII и IX. По-видимому, риск выработки антител при генотерапии зависит от выбора вектора, дозы и ткани-мишени (Kaufman, 1999).
=== Гемоглобинопатии ===
Серповидноклеточная анемия и талассемии — распространенные тяжелые моногенные болезни. Теоретически эти заболевания можно лечить с помощью трансфекции стволовых кроветворных клеток ex vivo с последующим введением больному. Основной трудностью является создание векторов, способных к длительной экспрессии трансгенов и синтезу достаточного количества нормального белка глобина (Emery and Stamatoyannopoulos, 1999; Persons and Nienhuis, 2000). Кроме того, разрабатываются методы генотерапии. основанные на транс-сплайсинге с помощью рибозимов и химеропластике (см. выше).
На сегодняшний лень наиболее успешным методом оказалось использование ретровирусных векторов, содержащих ген β-цепи глобина и различные участки локус-контролирующей области — основного регулятора транскрипции всего кластера генов P-цепей глобина. Хотя в стволовые кроветворные клетки с помощью ретровирусных векторов были успешно введены гены P-цепей глобина человека, длительной экспрессии этих генов в костном мозге экспериментальных животных добиться пока не удалось. Возможно, применение лентивирусных векторов позволит повысить эффективность трансфекции и встраивания генов p-цепей глобина вместе с большими участками ло-кус-контролирующей области в геном стволовых кроветворных клеток (May et al., 2000).
Слабая и преходящая экспрессия генов p-цепей глобина в стволовых кроветворных клетках после трансплантации объясняется замолканием трансгена и нестабильным эффектом положения (Rivella and Sadelain, 1998). Замолкание трансгена — это, скорее всего, эпигенетический процесс, приводящий к подавлению экспрессии у потомков модифицированной стволовой клетки. Возможно, эту проблему удастся решить, удалив из вектора или изменив некоторые последовательности вирусных длинных концевых повторов. Нестабильный эффект положения ведет к большим различиям в экспрессии трансгена у потомков модифицированной стволовой клетки, несмотря на одинаковое положение трансгена в геноме. Ретровирусные векторы, содержащие очень большие участки локус-контролирующей области, нестабильны и в процессе репродукции подвержены генетическим перестройкам.
Отбор клеток после трансфекции снижает риск замолкания трансгена и постепенного снижения экспрессии с возрастом животного. При этом отбирают только такие стволовые кроветворные клетки, в которых трансген активен. Критерием отбора ex vivo может быть синтез белка-маркера (Kalberer et al.2000). Другой подход основан на негативной селекции: в стволовые кроветворные клетки одновременно вводят второй трансген, обеспечивающий устойчивость к какому-либо цитотоксическому препарату (Emery and Stamatoyannopoulos, 1999).
=== Болезни легких ===
Легкие представляют уникальную возможность доставки генетических векторов непосредственно в эпителий дыхательных путей. В клинических испытаниях генетический материал обычно вводят в виде аэрозоля (Ennist, 1999). Однако, несмотря на кажущуюся доступность, эпителий дыхательных путей исключительно устойчив к внедрению чужеродных частиц, будь то вирусные векторы или невирусные системы доставки генов. Существуют многочисленные препятствия к введению генов в клетки эпителия с помощью аэрозолей (Boucher, 1999): восходящий ток слизи, удаляющий введенные препараты из дыхательных путей; гликокаликс, препятствующий связыванию с клеточными рецепторами; низкая плотность рецепторов на апикальной мембране клетки и ее ограниченная способность к эндоцитозу.
Для генотерапии наследственных болезней легких использовали несколько систем доставки генов (Albelda et al., 2000). Идеально подходят для этой цели аденовирусные векторы, поскольку они обладают естественной тропностью к эпителию дыхательных путей. Однако в нескольких исследованиях была показана низкая эффективность этих векторов вследствие кратковременности экспрессии трансгена и способности вызывать иммунный ответ (Welsh, 1999). Аденоассоциированные векторы, возможно, обеспечат более стойкую экспрессию и меньшую иммуногенность.
'''Муковисцидоз'''. Более 10 лет назад был открыт ген CFTR, мутации которого вызывают муковисцидоз. С той поры осуществлены многочисленные попытки разработать безопасный и эффективный способ доставки нормальных копий этого гена в эпителий дыхательных путей больных (Boucher, 1999). Опубликованы результаты нескольких клинических испытаний, в большинстве случаев в них использовали аденовирусные векторы с целью трансфекции эпителия носовой полости или легких. В целом аденовирусные векторы способны осуществить доставку генов, однако при их применении доля модифицированных клеток незначительна, а экспрессия трансгена обычно продолжается не более нескольких суток (Grubb et al., 1994; Zuckerman et al., 1999). Кроме того, иммунный ответ снижает эффективность последующих введений вектора (Harvey et al., 1999).
Сейчас проводят клинические испытания аденоассоциированных векторов. В экспериментальных исследованиях с помощью этих векторов была получена длительная экспрессия трансгена на фоне незначительного иммунного ответа. В одном клиническом испытании десяти больным муковисцидозом ген CFTR вводили в клетки эпителия верхнечелюстных пазух (Drapkin et al., 2000). Получены обнадеживающие результаты, однако предстоит еще многое сделать, чтобы выяснить долговременную безопасность и эффективность этого вектора. Изучается и доставка векторов с помощью липосом. Данные трех клинических испытаний подтверждают возможность такой доставки. Однако, как и в случае аденовирусного вектора, с помощью липосом удалось достичь лишь кратковременной экспрессии трансгена (Albelda et al., 2000).
Сейчас проверяется несколько новых подходов, повышающих эффективность трансфекции клеток эпителия дыхательных путей с помощью вирусных векторов. Поскольку большинство рецепторов к вирусным векторам находится на базолатеральной мембране этих клеток, разрыв плотных контактов, как показывают эксперименты, увеличивает эффективность трансфекции при нанесении вектора на апикальную мембрану клетки (Boucher, 1999). Однако вряд ли этот подход удастся безопасно применить в клинике. В других исследованиях вектор модифицировали таким образом, чтобы обеспечить взаимодействие с рецепторами апикальной мембраны. Два таких модифицированных вектора повышали эффективность трансфекции in vitro: одному придавали сродство к пуриновым рецепторам с помощью моноклональных антител (Boucher, 1999), а второму — к рецепторам урокиназы с помощью небольших пептидных лигандов (Drapkin et al., 2000).
'''Недостаточность а1-антитрипсина'''. Это наследственное заболевание ведет к эмфиземе легких и циррозу печени. Ткань легких становится чувствительной к повреждающему действию протеаз нейтрофилов, которые выделяются в очагах воспаления. Хотя а1-антитрипсин в норме не вырабатывается эпителием дыхательных путей, считается, что введение гена а1-антитрипсина в эти клетки окажет защитное действие налегкие (Albelda et al., 2000).
Сейчас для лечения обычно используют рекомбинантный агантитрипсин. Препарат стоит очень дорого, его вводят в виде еженедельных в/в инфузий, что сопряжено с риском осложнений. В доклинических исследованиях показано, что трансгены в составе комплекса плазмиды с катионными липосомами можно ввести в легкие через кровь или через дыхательные пути (Canonico et al., 1994). В одном клиническом испытании комплекс плазмиды с липосомами использовали для доставки гена а1-антитрипсина в эпителий носовой полости больных с недостаточностью этого белка, после чего локальная внеклеточная концентрация осрантитрипсина достигла трети от нормальной величины (Brigham et al., 2000). Кроме того, экспрессия трансгена в слизистой носовой полости оказывала местное противовоспалительное действие, которое отсутствовало при длительном лечении путем в/в инфузий рекомбинантного белка.
=== Миопатии ===
Огромный интерес вызывает генотерапия наследственных заболеваний скелетных мышц, включая миопатию Дюшенна и тазово-плечевую миопатию. Зрелая ткань скелетных мышц имеет ряд уникальных особенностей — как облегчающих, так и затрудняющих доставку трансгенов (Hartigan-O’Connorand Chamberlain, 2000). Провести локальную трансфекцию клеток скелетных мышц можно путем прямой инъекции плазмидной ДНК, с помощью вирусного вектора или другого способа доставки.
Кроме того, можно осуществить трансфекцию миобластов ex vivo (Floyd et al., 1998).
Системная доставка генов в мышцы затруднена из-за большой массы ткани и барьера на пути векторов из сосудистого русла к мембране миоцитов, состоящего из эндотелия сосудов и внеклеточного матрикса. Было разработано несколько способов преодоления этого барьера. Наиболее успешным было применение медиатора воспаления гистамина. Водном исследовании в бедренные артерии хомяков с кардиомиопатией, вызванной мутацией гена 5-саркогликана, последовательно вводили вазодилататор (папаверин), гистамин и аденоассоциированный вектор, содержавший маркерный ген (например, ген р-галактозидазы) или нормальный ген S-саркогликана (Greelish et al., 1999). Гистамин увеличивал проницаемость барьера в мышцах задних конечностей, что обеспечивало эффективное введение обоих трансгенов в клетки разных участков мышц.
Существуют и другие препятствия для трансфекции мышечных клеток с помощью некоторых вирусных векторов. Аденовирусы плохо заражают зрелую скелетную мышцу, поскольку на поверхности мышечных клеток мало рецепторов вирусов Коксаки и аденовирусов, необходимых для прикрепления к клетке и интернализации вируса (Nalbantoglu et al., 1999). Более эффективной трансфекции можно добиться на незрелых мышечных волокнах (Acsadi et al., 1994). Напротив, при использовании герпесвирусного вектора эффективность трансфекции in vitro не зависит от степени зрелости клеток (van Deutekom et al., 1998). С помощью аденовирусного вектора удалось ввести трансген в скелетные мышцы экспериментальных животных, но в большинстве случаев его экспрессия была непродолжительной из-за иммунного ответа на вирусную инфекцию. Аденовирусные векторы также способны вызывать трансфекцию скелетных мышц взрослых животных (Fisher et al., 1997). В некоторых экспериментах экспрессия трансгена продолжалась на протяжении 2 лет.
'''Миопатия Дюшенна'''. Это Х-сцепленное рецессивное заболевание, вызванное отсутствием цитоскелетного белка дистрофина. Длина нуклеотидной последовательности, кодирующей дистрофии, очень велика (14 000 нуклеотидов), поэтому для ее доставки нельзя использовать вирусные векторы ограниченной емкости, такие, как аденовирусные векторы первого поколения и аденоассоциированные векторы. Новейшие аденовирусные векторы, способные нести полный ген дистрофина, в экспериментах на животных с миопатией (например, мышах линии mdx) вызывали трансфекцию мышечных клеток при введении в мышцу (Clemens et al., 1996). Кроме того, вирусные векторы, содержащие ген утрофина (родственный дистрофину белок), оказывают положительный эффект у мышей линии mdx (Rafael et al., 1998).
'''Тазово-плечевая миопатия'''. Это группа сходных наследственных заболеваний, включающая несколько генетических форм. Причиной четырех форм заболевания являются мутации генов а-, β-, у- и 8-саркогликанов. Саркогликаны — это трансмембранные гликопротеиды, образующие комплекс с дистрофином. Заболевание, вызванное дефектом в одном из этих гликопротеидов, во многом сходно с миопатией Дюшенна. В отличие от дистрофина, саркогликаны имеют небольшие размеры, и кодирующие их последовательности длиной менее 2000 нуклеотидов могут быть легко включены в аденоассоциированный вектор. Эксперименты показали возможность восстановления синтеза саркогликанов у мышей и хомяков с миопатией (Greelish et al., 1999). Сейчас проводятся клинические испытания эффективности и безопасности в/м введения гена саркогликана в составе аденоассоциированного вектора (Stedman et al., 2000).
== Перспективы ==
Потребность в генотерапии наследственных болезней будет, безусловно, расти по мере открытия новых генетических нарушений и выяснения их патогенеза. Кроме того, с увеличением наших знаний об аллельной гетерогенности как основы различной предрасположенности к заболеваниям генотерапия может стать важным способом лечения и для распространенных болезней. По мере наступления эры генетической медицины необходимость в улучшении методов трансфекции и в создании новых подходов к лечению только увеличивается.
== Читайте также ==
*[[Генная терапия наследственных заболеваний]]
*[[Генная терапия отдельных заболеваний]]
*[[Вирусные векторы (генотерапия)]]
*[[Невирусная доставка генов (генотерапия)]]
*[[Эктопический синтез белков (генотерапия)]]
*[[Генотерапия рака (злокачественных опухолей)]]
== Литература ==
