Редактирование: Генотерапия рака (злокачественных опухолей)

{{Клинфарм1}}
== Генотерапия злокачественных новообразований ==

Общепризнано, что злокачественная трансформация клетки происходит в результате накопления генетических дефектов, приводящих к безудержной пролиферации. Сейчас разрабатываются несколько способов коррекции этих дефектов как основы будущей генотерапии (Gomez-Navarro etal., 1999). Более половины всех разрешенных клинических испытаний методов генотерапии направлено на лечение злокачественных новообразований. В некоторых случаях генотерапия может заменить обычные методы лечения, в других — стать вспомогательным методом.

Развитие злокачественного новообразования — исключительно сложный процесс (гл. 52), и поэтому для лечения таких новообразований разрабатываются различные методы генотерапии. Открытие роли онкогенов и генов — супрессоров опухолевого роста в развитии заболевания привело к созданию методов соответственно подавления или активации этих генов. Другие подходы — придание опухолевым клеткам способности превращать вводимый в организм препарат-предшественник в токсичный метаболит (самоубийство клеток-мишеней) или избирательное разрушение клеток вирусом (онксшитические вирусы). Наоборот, введение в нормальные клетки генов, придающих устойчивость к действию противоопухолевых средств, может защитить эти клетки при проведении высокодозной химиотерапии. Наконец, иммуномодуляторы способны активировать противоопухолевый иммунитет. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки, а также специфические особенности, препятствующие их практическому применению.

Генотерапия злокачественных новообразований сталкивается со многими сложностями. Для излечения необходимо подействовать на все опухолевые клетки. Поскольку для злокачественных новообразований характерны метастазы, необходимо обеспечить доставку генов в разные органы и ткани. Не менее важно обеспечить строгую избирательность генотерапии: в идеале генетический вектор должен действовать только на опухолевые клетки, не влияя на нормальные. В современных методах такая избирательность достигается благодаря использованию молекулярных маркеров опухолевых клеток или промоторов, специфичных для опухолей (Curiel, 1999; Nettelbecket al., 2000). Возможно, учитывая генетическую гетерогенность трансформированных клеток, придется использовать сочетание нескольких методов.

=== Инактивация онкогенов === 

Известно несколько онкогенных белков, характерных для определенных опухолей (Park, 1998). Для подавления экспрессии этих белков на уровне транскрипции или трансляции был предложен ряд подходов. В проходящих сейчас клинических испытаниях чаще всего используют антисмысловые олигонуклеотиды (Gewirtz et al., 1998). Однако недостаточно эффективная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки и разная степень подавления экспрессии онкогенов существенно затрудняют этот подход. Транскрипцию онкогенов можно также подавить с помощью аденовирусного белка Е1А, блокирующего, в частности, транскрипцию онкогена ERBB2. Этот метод перспективен для лечения рака молочной железы или яичников, при которых наблюдается повышенная экспрессия данного онкогена (Gomez-Navarro et al., 1999).

=== Активация генов — супрессоров опухолевого роста === 

Сейчас известно более 24 таких генов, а их мутации обнаружены при многих видах злокачественных новообразований (Fearon, 1998). Поэтому были сделаны попытки замены или исправления мутантных генов в опухолевых клетках. В нескольких клинических испытаниях проверяют способность аденовирусных векторов усилить синтез белка р53 при нескольких видах злокачественных новообразований (Gomez-Navarro et al., 1999). С помощью вирусных векторов в опухолевые клетки вводили также ген ретинобластомы и ген BRCA1 при раке мочевого пузыря и яичников соответственно. Этот подход оказался эффективным, хотя и не всегда. В некоторых случаях неудачи были связаны с доминантно-негативным действием мутантного гена. Для преодоления этой сложности предлагается использовать методы коррекции генетических нарушений (см. предыдущий раздел; Watanabe and Sullenger, 2000).

Самоубийство клеток-мишеней. Превращение препарата-предшественника в токсичный метаболит генетически модифицированными опухолевыми клетками — перспективный способ лечения злокачественных новообразований (Springer and Nicu-lescu-Duvaz, 2000). Этого можно достичь с помощью экспрессии в опухолевых клетках одного из ферментов, способных превращать препарат-предшественник в токсичный метаболит и тем самым убивать эти клетки (табл. 5.2). Если для трансфекции использовать ген, в норме не встречающийся у человека (например, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса), избирательность будет больше, чем при активации эндогенного гена (например, гена дезоксицитидинкиназы).

В первой такой системе использовали ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа 1 в сочетании с препаратом-предшественником ганцикловиром (Morris etal., 1999). Тимидинкиназа вируса простого герпеса, а затем клеточные тимидинкиназы фосфорилируют ганцикловир, превращая его в ганцикло-виртрифосфат. Последний встраивается в синтезируемую цепь ДНК и блокирует репликацию и транскрипцию ДНК. Эффективность и безопасность этого метода сейчас проверяют в нескольких клинических испытаниях у больных с различными злокачественными новообразованиями. Основной недостаток метода — низкая избирательность доставки гена тимидинкиназы. Нормальные клетки, особенно гепатоциты, также могут приобрести чувствительность к ганцикловиру. Другая сложность — необходимость трансфекции всех опухолевых клеток. Преодолеть ее частично помогает действие токсичного вещества не только на клетку, где оно синтезировалось, но и на соседние клетки. Ганцикловиртрифосфат действует на соседние клетки только при сохранении функции щелевых контактов между клетками, так как клеточные мембраны непроницаемы для него. Комбинация двух и более ферментов, образующих токсичные продукты, может оказаться более эффективной за счет сочетания разных механизмов токсического действия.

Таблица 5.2. Генотерапия злокачественных новообразований методом самоубийства клеток-мишеней

<table border="1">
<tr><td>
<p>Фермент</p></td><td>
<p>Препарат-предшественник</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Тимидинкиназа вируса простого герпеса</p></td><td>
<p>Ганцикловир</p>
<p>Ацикловир</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Тимидинкиназа вируса везикулярного стоматита</p></td><td>
<p>6-метоксипуринарабинозид</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Дезоксицитидинкиназа</p></td><td>
<p>Цитарабин</p>
<p>Флударабин</p>
<p>Кладрибин</p>
<p>Гемцитабин</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Цитозиндезаминаза</p></td><td>
<p>Фторцитозин</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Нуклеозидфосфорилаза</p></td><td>
<p>6-метилпуриндезоксирибозид</p></td></tr>
<tr><td colspan="2">
<p>Нуклеозидфосфорилазу кодирует ген DeoD Е. coli, транскрибируемый участок которого и был использован.</p></td></tr>
</table>

Основное ограничение этого подхода — необходимость создания высокой местной концентрации вектора с целью трансфекции всех или почти всех опухолевых клеток без влияния на другие ткани. Возможно также появление устойчивых клонов опухолевых клеток.

=== Защита нормальных клеток === 

Методы генной инженерии можно использовать для придания нормальным клеткам костного мозга большей устойчивости к высокодозной химиотерапии. Механизмы, позволяющие опухолевым клеткам выживать в условиях химиотерапии, хорошо описаны для некоторых цитостатиков (гл. 52). Гены, ограничивающие эффективность химиотерапии, можно использовать для защиты нормальных клеток.

Большое внимание было привлечено к гену АВСВ1 (старое название MDR-1), кодирующему Р-гликопротеид. Этот трансмембранный гликопротеид выводит многие цитостатики (доксорубицин, алкалоиды розового барвинка, этопозид, паклитак-сел) и другие препараты из клетки, тем самым защищая клетку от их токсического действия (Gottesman et al., 1994). Для злокачественных новообразований характерна дозозависимая чувствительность к цитостатикам, поэтому большие дозы сильнее подавляют опухолевые клетки и улучшают прогноз (гл. 52). Например, злокачественные опухоли яичка часто излечимы при назначении высоких доз цитостатиков. К сожалению, токсическое действие на нормальные ткани, особенно на костный мозг, часто препятствует повышению дозы. Чтобы восстановить функцию костного мозга после высокодозной химиотерапии, используют его аутотрансплантацию. Этот же принцип лежит в основе разрабатываемого метода генотерапии, в котором для придания клеткам костного мозга устойчивости к цитостатикам используют ген АВСВ1 (Aran et al., 1999).

Клинические испытания показали принципиальную возможность и безопасность введения гена АВСВ1 в стволовые клетки костного мозга и периферической крови у больных, получающих высокодозную химиотерапию при поздних стадиях злокачественных новообразований (Cowan etal., 1999; Devereux etal., 1998; Hanania et al., 1996; Hesdorfferet al., 1998; Moscow et al., 1999). Во всех работах трансфекцию различных клеток ex vivo производили с помощью ретровирусных векторов, не способных к репродукции. В целом эффективность трансфекции и число успешных приживлений костного мозга были низкими. Однако предварительная обработка цитокинами и добавление фрагментов фибронектина, обеспечивающих клеточную адгезию, повышали эффективность трансфекции стволовых клеток и продолжительность экспрессии трансгена после трансплантации (Abonour et al., 2000).

=== Онколитические вирусы === 

Некоторые вирусы, в том числе аденовирусы и вирус простого герпеса типа 1, могут заражать и лизировать опухолевые клетки (Alemany et al., 2000; Heise and Kim, 2000). В большинстве методов генотерапии специально подавляют способность вируса к репродукции. Напротив, разрушение опухолевых клеток возможно только при репродукции вируса в них. Использование онколитических вирусов вместе с другими методами генотерапии — перспективный метод комплексной терапии злокачественных новообразований (Hermiston, 2000).

Репродукция вируса в опухолевой клетке ведет к ее лизису и заражению соседних опухолевых клеток, то есть происходит увеличение дозы относительно первоначальной. Поскольку разрушение опухолевых клеток и есть цель лечения, нет необходимости в длительной экспрессии трансгенов в клетках-мишенях. В большинстве экспериментов по разработке этого метода генотерапии использовали способные к репродукции аденовирусы и вирус простого герпеса типа 1.

Применяют два способа, обеспечивающих избирательность заражения опухолевых клеток. Во-первых, вирусные гены, необходимые для репродукции (например, аденовирусный ген Е1А), могут находиться под контролем промотора, специфичного для опухоли. Во-вторых, можно удалить вирусные гены, необходимые для репродукции в нормальных клетках, но излишние при репродукции в опухолевых клетках. Например, аденовирусный ген Е1В, кодирующий белок Е1b55к, необходим для репродукции вируса в нормальных клетках, экспрессирующих белок р53. Вирус, лишенный этого гена (штамм ONYX-O15), размножается только в тех опухолевых клетках (и лизирует их), в которых нет активного белка р53 (Dix et al., 2000). На первом этапе клинических испытаний больные с рецидивирующими опухолями головы и шеи хорошо переносили внутриопухолевое введение штамма ONYX-O15, а в месте инъекции происходил некроз опухоли (Ganly et al., 2000). Другой пример: после делеции гена, кодирующего рибонуклеозиддифосфатредуктазу, вирус простого герпеса способен к репродукции только в опухолевых клетках с высокой активностью этого фермента. Хотя вирус простого герпеса обладает естественной тропностью к нервной ткани, показано онколитическое действие герпесвирусных векторов и на злокачественные новообразования других тканей (Yoon et al., 2000).

Вероятно, большей эффективности можно добиться путем сочетания онколитических вирусов с другими методами генотерапии. Созданы способные к репродукции аденовирусные и герпесвирусные векторы, которые несут гены одного или двух ферментов, превращающих препарат-предшественник в токсичный метаболит. Показано, что способные к репродукции герпесвирусные векторы, содержащие крысиный ген цитохрома Р450 (CYP2B1) или ген тирозинкиназы вируса простого герпеса, делают клетки глиомы чувствительными к действию соответственно циклофосфамида и ганцикловира (Aghi et al., 1999). Был сконструирован аденовирусный вектор, содержащий гены двух ферментов: тирозинкиназы вируса простого герпеса (обеспечивает чувствительность к ганцикловиру) и цитозиндезаминазы (обеспечивает чувствительность к фторцитозину). Введение этого вектора мышам после трансплантации клеток рака шейки матки значительно увеличивало эффективность лучевой терапии (Rogulski et al., 2000).

Онколитические вирусы могут стимулировать противоопухолевый иммунный ответ, развивающийся как на вирусные антигены, так и на специфические опухолевые антигены, выделяющиеся при лизисе клеток (Agha-Mohammadi and Lotze, 2000). Предполагается, что эта активация иммунного ответа способна уничтожить метастазы после лечения первичной опухоли. Дополнительное влияние на иммунный ответ может обеспечить вирусный вектор, содержащий гены различных цитокинов. 

=== Действие на иммунную систему === 

Большинство опухолевых клеток обладают слабой иммуногенностью, а развитие злокачественного новообразования может быть следствием нарушения противоопухолевого иммунитета. Различные цитокины усиливают иммунный ответ на опухолевые клетки. На этом основана разработка новых методов генотерапии злокачественных новообразований (Agha-Mohammadi and Lotze, 2000).

'''Эктопический синтез цитокинов'''. Показано, что некоторые цитокины подавляют рост опухоли, если они синтезируются в опухолевых или соседних с ними клетках (Tepper and Mule, 1994). Модифицированные опухолевые клетки, синтезирующие определенные цитокины, реже образуют опухоли после введения сингенным животным, тогда как их пролиферация in vitro не нарушена. Таким образом, действие цитокинов опосредовано какими-то системами организма. Некоторые иммуностимуляторы не влияют на скорость роста имеющейся опухоли, но препятствуют развитию опухоли при введении немодифицированных опухолевых клеток в дальнейшем. Очевидно, что модифицированные опухолевые клетки вызывают различные реакции иммунной системы организма в зависимости от синтезируемого иммуномодулятора. Например, секреция ИЛ-4 опухолевыми клетками приводит к мощной местной воспалительной реакции без какого-либо влияния на отдаленные метастазы или на опухолевые клетки, введенные позже. ГМ-КСФ почти на влияет на пролиферацию клеток, но вызывает выраженный противоопухолевый иммунный ответ (Dranoff et al., 1993). Наиболее эффективно введение в опухолевые клетки генов нескольких цитокинов. Подтверждена стимуляция противоопухолевого иммунитета различными комбинациями интерлейкинов, интерферона у и ГМ-КСФ. Как уже сказано, для введения генов цитокинов наиболее перспективно использование способных к репродукции вирусных векторов, так как это дает комбинированный лечебный эффект.

'''Усиление иммунного ответа'''. Существуют и другие подходы, направленные на усиление противоопухолевого иммунитета. Один из них заключается в экспрессии на мембране опухолевой клетки высокоиммуногенных молекул, например чужеродных антигенов HLA. Можно также модифицировать опухолевые клетки так, чтобы лучше распознавались собственные слабые антигены опухолевых клеток. Хорошо известно, что в активации Т-лимфоцитов помимо антигенраспознающих рецепторов участвуют и другие молекулы (гл. 53). К ним относятся, например, молекулы CD80 и CD86. В норме CD80, расположенные только на поверхности антигенпредставляющих клеток и некоторых других клеток иммунной системы, взаимодействуют с рецепторами CD28 и CD 152 (CTLA-4) Т-лимфоцитов одновременно с активацией антигенраспознающих рецепторов. Затем происходит активация и пролиферация Т-лимфоцитов, выделяются цитокины — развивается противоопухолевый иммунный ответ. Если во время связывания антигенраспознающих рецепторов с антигеном дополнительное взаимодействие отсутствует, то Т-лимфоциты не активируются и, более того, происходит угнетение противоопухолевого иммунитета. В этом случае опухолевые антигены вместо иммунного ответа вызывают толерантность. Именно это наблюдается у большинства больных — злокачественные новообразования не встречают заметного противодействия иммунной системы. Если заставить опухолевые клетки синтезировать указанные выше дополнительные молекулы, то Т-лимфоциты будут успешно активироваться. Это было подтверждено в эксперименте, где модифицированные опухолевые клетки, синтезировавшие молекулы CD80 и CD86, вызывали иммунный ответ на исходные опухолевые клетки.

== ДНК-вакцины ==

С помощью антигенов, кодируемых трансгенами, можно провести вакцинацию против инфекционных и неинфекционных заболеваний (Gurunathan et al., 2000; Kowalczyk and Ertl, 1999). В клетки кожи или мышц легко ввести бактериальную плазмиду с геном, кодирующим нужный антиген. Синтезированный антиген вызывает гуморальный и клеточный иммунный ответ. Преимуществом ДНК-вакцин перед обыкновенными белковыми вакцинами является стимуляция Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Кроме того, производство ДНК-вакцин относительно дешево и при их применении нет риска побочного действия, как после введения ослабленных возбудителей. Показано, что наличие в неметилированной плазмиде последовательности пурин—пурин—цитозин—гуанин—пиримидин—пиримидин стимулирует пролиферацию лимфоцитов и выброс цитокинов, что способствует развитию иммунного ответа (Roman et al., 1997; Sato et al., 1996). Основной недостаток ДНК-вакцин — относительно слабый гуморальный иммунный ответ, а также теоретически возможные инсерционный мутагенез и аутоиммунный ответ.

Сейчас проходят доклинические и клинические испытания ДНК-вакцин, предназначенных для лечения различных инфекционных и паразитарных заболеваний, злокачественных новообразований и аллергии. Недавно показана принципиальная возможность и безопасность использования ДНК-вакцины против ВИЧ-инфекции (Boyer et al., 2000).