Спорт-вики — википедия научного бодибилдинга
Редактирование: Нингидриновая реакция на определение аминокислот и белка
Внимание! Вы не авторизовались на сайте. Ваш IP-адрес будет публично видимым, если вы будете вносить любые правки. Если вы войдёте или создадите учётную запись, правки вместо этого будут связаны с вашим именем пользователя, а также у вас появятся другие преимущества.
Правка может быть отменена. Пожалуйста, просмотрите сравнение версий, чтобы убедиться, что это именно те изменения, которые вас интересуют, и нажмите «Записать страницу», чтобы изменения вступили в силу.
Текущая версия | Ваш текст | ||
Строка 1: | Строка 1: | ||
== Спектрофотометрическое исследование продуктов нингидриновой реакции == | == Спектрофотометрическое исследование продуктов нингидриновой реакции == | ||
− | Разработка точных, доступных методов анализа а- | + | Разработка точных, доступных методов анализа а-аминокислот является одной из актуальных задач современной фармации. |
В настоящее время существует ряд методов количественного определения а-аминокислот в лекарственном растительном сырье, в лекарственных препаратах и биологических жидкостях [1—31]. Однако, несмотря на высокую точность, их применение ограничено длительностью приготовления рабочих растворов (потенциометрическое титрование в неводной среде), дороговизной оборудования (ГЖХ, ВЭЖХ) [4, 6,27,28, 30]. | В настоящее время существует ряд методов количественного определения а-аминокислот в лекарственном растительном сырье, в лекарственных препаратах и биологических жидкостях [1—31]. Однако, несмотря на высокую точность, их применение ограничено длительностью приготовления рабочих растворов (потенциометрическое титрование в неводной среде), дороговизной оборудования (ГЖХ, ВЭЖХ) [4, 6,27,28, 30]. | ||
Строка 8: | Строка 8: | ||
Khan А. с соавторами изучили механизм нингидриновой реакции [29]: | Khan А. с соавторами изучили механизм нингидриновой реакции [29]: | ||
− | + | ||
На первой стадии реакции о-аминокислот с нингидрином (I) образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение - 2-аминоиндандион (II), участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона (III) и 2-иминоиндандиона (IV), которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин (V). Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин (VI). | На первой стадии реакции о-аминокислот с нингидрином (I) образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение - 2-аминоиндандион (II), участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона (III) и 2-иминоиндандиона (IV), которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин (V). Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин (VI). | ||
− | Установлено, что характерная для большинства а-аминокислот пурпурная окраска(окраска Румана) обусловлена образованием дикетогидринденкетогидринамина (V), а также продукта параллельной реакции - гидриндантина (VI), который мало растворим в воде и растворим в органических растворителях - диметилсульфоксиде (ДМСО) и метилцелозольве. Поэтому, с целью повышения чувствительности реакции, по предположению авторов, наиболее рационально использовать растворы нингидрина в указанных растворителях. Максимальные значения оптической плотности продуктов реакции (при длине волны 575 нм) наблюдаются при соблюдении следующих условий ее проведения: температура реакционной смеси - 95 °С, pH — 5-6. Кроме того, реакцию необходимо проводить без доступа кислорода, в атмосфере азота. | + | Установлено, что характерная для большинства а-аминокислот пурпурная окраска(окраска Румана) обусловлена образованием дикетогидринденкетогидринамина (V), а также продукта параллельной реакции -гидриндантина (VI), который мало растворим в воде и растворим в органических растворителях - диметилсульфоксиде (ДМСО) и метилцелозольве. Поэтому, с целью повышения чувствительности реакции, по предположению авторов, наиболее рационально использовать растворы нингидрина в указанных растворителях. Максимальные значения оптической плотности продуктов реакции (при длине волны 575 нм) наблюдаются при соблюдении следующих условий ее проведения: температура реакционной смеси - 95 °С, pH — 5-6. Кроме того, реакцию необходимо проводить без доступа кислорода, в атмосфере азота. |
Для детектирования продукта нингидриновой реакции используют спектрофотометры, флуориметры. | Для детектирования продукта нингидриновой реакции используют спектрофотометры, флуориметры. | ||
Строка 17: | Строка 17: | ||
Широкое распространение в анализе аминокислот получили аминокислотные анализаторы [1,9,11,13—15, 17]. Данный метод основан на разделении аминокислот с помощью ионообменной хроматографии с последующим фотоколориметрическим определением продуктов реакции аминокислот с нингидрином. Применение аминокислотных анализаторов позволяет разделить исследуемый образец на отдельные компоненты и определить их количество быстро и с высокой точностью. Главным недостатком данного метода анализа является высокая стоимость оборудования, что делает его недоступным для большинства лабораторий. | Широкое распространение в анализе аминокислот получили аминокислотные анализаторы [1,9,11,13—15, 17]. Данный метод основан на разделении аминокислот с помощью ионообменной хроматографии с последующим фотоколориметрическим определением продуктов реакции аминокислот с нингидрином. Применение аминокислотных анализаторов позволяет разделить исследуемый образец на отдельные компоненты и определить их количество быстро и с высокой точностью. Главным недостатком данного метода анализа является высокая стоимость оборудования, что делает его недоступным для большинства лабораторий. | ||
− | Более доступными и простыми являются | + | Более доступными и простыми являются фотоколориметр ические и спектрофотометрические методы анализа о-аминокислот, основанные на их взаимодействии с нингидрином. Так, В.А. Храмовым модифицирован метод определения диаминокислот по Чинарду [12]. Метод основан на образовании красно-коричневых продуктов взаимодействия диаминокислот с нингидрином с последующим фотоколориметрическим определением при длине волны 490 нм. Метод является специфичным: нейтральные аминокислоты, а также амины и диамины при pH 1 с нингидрином окрашенных продуктов не образуют. Несмотря на доступность и простоту данный метод не является универсальным для всех а-аминокислот и позволяет определить лишь диаминокислоты, из которых наибольшее практическое значение имеет незаменимая аминокислота лизин. Кроме того, этим методом можно определить пролин. |
− | Разработана точная методика количественного определения кислоты аспарагиновой в лекарственном препарате | + | Разработана точная методика количественного определения кислоты аспарагиновой в лекарственном препарате «Аспаркам», основанная на ее взаимодействии с 1 % этаноловым раствором нингидрина и последующим определением оптической плотности продукта реакции при длине волны 568 нм. Метод отличается хорошей воспроизводимостью, относительная ошибка среднего результата составила ±2,25 % [19]. Кроме того, предложен спектрофотометрический метод анализа суммы аминокислот различных видов пыльцы, основанный на взаимодействии с 2 % этаноловым раствором нингидрина [11]. |
С этих позиций представляет интерес изучение спектральных характеристик продуктов нингидриновой реакции 20-ти наиболее важных в биологическом отношении а-аминокислот, оптимизация условий ее проведения с целью разработки точного и доступного метода количественного определения а-аминокислот в растительном сырье, субстанциях и суммарных лекарственных препаратах. | С этих позиций представляет интерес изучение спектральных характеристик продуктов нингидриновой реакции 20-ти наиболее важных в биологическом отношении а-аминокислот, оптимизация условий ее проведения с целью разработки точного и доступного метода количественного определения а-аминокислот в растительном сырье, субстанциях и суммарных лекарственных препаратах. | ||
Строка 30: | Строка 30: | ||
Исследование спектров поглощения в видимой области показало наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 399-405 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 19-ти из 20-ти а-аминокислот (рис. 1-4). Исключение составляет пролин, продукт реакции которого с нингидрином имеет один максимум поглощения в видимой области — при длине волны 416 нм, что объясняется отсутствием первичной аминогруппы в структуре данной аминокислоты. | Исследование спектров поглощения в видимой области показало наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 399-405 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 19-ти из 20-ти а-аминокислот (рис. 1-4). Исключение составляет пролин, продукт реакции которого с нингидрином имеет один максимум поглощения в видимой области — при длине волны 416 нм, что объясняется отсутствием первичной аминогруппы в структуре данной аминокислоты. | ||
− | |||
− | + | Рис 1. Видимая область спектра продуктов взаимодействия о-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | |
+ | |||
+ | Рис 2. Видимая область спектра продуктов взаимодействия df-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | ||
− | + | Рис 3. Видимая область спектра продуктов взаимодействия о-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | |
− | + | Рис 4. Видимая область спектра продуктов взаимодействия о-аминокислот с ОД % раствором нингидрина в ацетоне | |
Исследована также УФ-область спектра продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и установлено, что все они также имеют два максимума поглощения в диапазонах длин волн 220-237 и 254-260 нм (рис. 5-8). Исключение составляет продукт реакции с пролином, максимумы поглощения которого составляют 299 и 343 нм. | Исследована также УФ-область спектра продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и установлено, что все они также имеют два максимума поглощения в диапазонах длин волн 220-237 и 254-260 нм (рис. 5-8). Исключение составляет продукт реакции с пролином, максимумы поглощения которого составляют 299 и 343 нм. | ||
− | |||
− | + | Рис 5. УФ-область спектра продуктов взаимодействия о-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | |
+ | |||
+ | Рис 6. УФ-область спектра продуктов взаимодействия о аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | ||
− | + | Рис 7. УФ-область спектра продуктов взаимодействия о-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | |
− | + | Рис 8. УФ-область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне | |
Максимумы поглощения (в видимой и УФ-области) продуктов взаимодействия 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне представлены в таблице 1. | Максимумы поглощения (в видимой и УФ-области) продуктов взаимодействия 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне представлены в таблице 1. | ||
Строка 63: | Строка 65: | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>1</p></td><td> | <p>1</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Аланин</p></td><td> |
<p>231,251</p></td><td> | <p>231,251</p></td><td> | ||
<p>401, 567</p></td></tr> | <p>401, 567</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>2</p></td><td> | <p>2</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Аргинин</p></td><td> |
<p>232,256</p></td><td> | <p>232,256</p></td><td> | ||
<p>400, 561</p></td></tr> | <p>400, 561</p></td></tr> | ||
Строка 78: | Строка 80: | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>4</p></td><td> | <p>4</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Аспарагиновая кислота</p></td><td> |
<p>230, 256</p></td><td> | <p>230, 256</p></td><td> | ||
<p>400,564</p></td></tr> | <p>400,564</p></td></tr> | ||
Строка 88: | Строка 90: | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>6</p></td><td> | <p>6</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Г истидин</p></td><td> |
<p>229, 255</p></td><td> | <p>229, 255</p></td><td> | ||
<p>401, 568</p></td></tr> | <p>401, 568</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>7</p></td><td> | <p>7</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Глицин</p></td><td> |
<p>231,256</p></td><td> | <p>231,256</p></td><td> | ||
<p>401,568</p></td></tr> | <p>401,568</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>8</p></td><td> | <p>8</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Глутамин</p></td><td> |
<p>230, 256</p></td><td> | <p>230, 256</p></td><td> | ||
<p>401,566</p></td></tr> | <p>401,566</p></td></tr> | ||
Строка 123: | Строка 125: | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>13</p></td><td> | <p>13</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Метионин</p></td><td> |
<p>230, 254</p></td><td> | <p>230, 254</p></td><td> | ||
<p>401,566</p></td></tr> | <p>401,566</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>14</p></td><td> | <p>14</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Серии</p></td><td> |
<p>230, 256</p></td><td> | <p>230, 256</p></td><td> | ||
<p>401,567</p></td></tr> | <p>401,567</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>15</p></td><td> | <p>15</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Треонин</p></td><td> |
<p>230, 256</p></td><td> | <p>230, 256</p></td><td> | ||
<p>402,567</p></td></tr> | <p>402,567</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>16</p></td><td> | <p>16</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Тирозин</p></td><td> |
<p>228, 258</p></td><td> | <p>228, 258</p></td><td> | ||
<p>400, 567</p></td></tr> | <p>400, 567</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>17</p></td><td> | <p>17</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Триптофан</p></td><td> |
<p>229,263</p></td><td> | <p>229,263</p></td><td> | ||
<p>401,568</p></td></tr> | <p>401,568</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>18</p></td><td> | <p>18</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Цистеин</p></td><td> |
<p>230, 257</p></td><td> | <p>230, 257</p></td><td> | ||
<p>401,566</p></td></tr> | <p>401,566</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>19</p></td><td> | <p>19</p></td><td> | ||
− | <p> | + | <p>Фенилаланин</p></td><td> |
<p>230, 255</p></td><td> | <p>230, 255</p></td><td> | ||
<p>401, 564</p></td></tr> | <p>401, 564</p></td></tr> | ||
Строка 177: | Строка 179: | ||
<table cellpadding="7" border="1"> | <table cellpadding="7" border="1"> | ||
<tr><td rowspan="2"> | <tr><td rowspan="2"> | ||
− | <p>№ п/п</p></td><td colspan="3"> | + | <p>№</p> |
+ | <p>п/п</p></td><td colspan="3"> | ||
<p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td rowspan="2"> | <p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td rowspan="2"> | ||
− | <p> | + | <p>Разведен</p> |
− | <p>Оптическая плотность продукта при | + | <p>ие</p> |
+ | <p>продукта</p> | ||
+ | <p>реакции</p> | ||
+ | <p>водой</p></td><td colspan="2"> | ||
+ | <p>Оптическая плотность продукта при Л=400 нм</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>Навеска фенилала нина, г</p></td><td> | <p>Навеска фенилала нина, г</p></td><td> | ||
Строка 304: | Строка 311: | ||
<table cellpadding="7" border="1"> | <table cellpadding="7" border="1"> | ||
<tr><td rowspan="2"> | <tr><td rowspan="2"> | ||
− | <p>№ п/п</p></td><td rowspan="2"> | + | <p>№</p> |
+ | <p>п/п</p></td><td rowspan="2"> | ||
<p>Продолжительность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2"> | <p>Продолжительность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2"> | ||
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2"> | + | <p>Разведение</p> |
− | <p>Оптическая плотность продукта при | + | <p>продукта</p> |
+ | <p>реакции</p> | ||
+ | <p>водой</p></td><td colspan="2"> | ||
+ | <p>Оптическая плотность продукта при Х=400 нм</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td> | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td> | ||
Строка 393: | Строка 404: | ||
<table cellpadding="7" border="1"> | <table cellpadding="7" border="1"> | ||
<tr><td rowspan="2"> | <tr><td rowspan="2"> | ||
− | <p>№ п/п</p></td><td rowspan="2"> | + | <p>I №</p> |
+ | <p>п/п</p></td><td rowspan="2"> | ||
<p>Температурный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2"> | <p>Температурный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2"> | ||
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2"> | + | <p>Разведение</p> |
− | <p>Оптическая плотность продукта при | + | <p>продукта</p> |
+ | <p>реакции</p> | ||
+ | <p>водой</p></td><td colspan="2"> | ||
+ | <p>Оптическая плотность продукта при Хг=400 нм</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td> | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td> | ||
Строка 451: | Строка 466: | ||
С целью выявления подчинения закону светопоглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне при длине волны 400 нм нами исследована зависимость светопоглощения от концентрации а-аминокислоты (рис. 9). | С целью выявления подчинения закону светопоглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне при длине волны 400 нм нами исследована зависимость светопоглощения от концентрации а-аминокислоты (рис. 9). | ||
− | + | ||
+ | Рис 9. Калибровочный график продукта реакции метионина | ||
На рис. 9 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия метионина с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне подчиняется закону светопоглощения при длине волны 400 нм в концентрациях от 0,005 до 0,02 мг/мл. | На рис. 9 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия метионина с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне подчиняется закону светопоглощения при длине волны 400 нм в концентрациях от 0,005 до 0,02 мг/мл. | ||
Строка 486: | Строка 502: | ||
На этом основании нами изучены продукты нингидриновой реакции в нелетучем растворителе - диметилсульфоксиде (ДМСО). | На этом основании нами изучены продукты нингидриновой реакции в нелетучем растворителе - диметилсульфоксиде (ДМСО). | ||
− | == Исследование реакции | + | == Исследование реакции о-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в диметилсульфоксиде === |
В следующей серии экспериментов в качестве растворителя для нингидрина мы использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Растворы нингидрина в ДМСО часто используют для количественного определения аминокислот с помощью аминокислотных анализаторов [1]. Важно отметить, что ДМСО имеет преимущества по сравнению с ацетоном: данный растворитель нелетучий, имеет невысокую токсичность, взрыво- и пожаробезопасен, что обеспечивает удобство его использования. | В следующей серии экспериментов в качестве растворителя для нингидрина мы использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Растворы нингидрина в ДМСО часто используют для количественного определения аминокислот с помощью аминокислотных анализаторов [1]. Важно отметить, что ДМСО имеет преимущества по сравнению с ацетоном: данный растворитель нелетучий, имеет невысокую токсичность, взрыво- и пожаробезопасен, что обеспечивает удобство его использования. | ||
Строка 495: | Строка 511: | ||
По аналогии с ацетоновым раствором нингидрина, нами изучена зависимость светопоглощения продукта реакции с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО от концентрации а-аминокислоты при длине волны 400 нм и установлено её подчинение закону светопоглощения Бугера - Ламберта - Бера (рис. 10). | По аналогии с ацетоновым раствором нингидрина, нами изучена зависимость светопоглощения продукта реакции с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО от концентрации а-аминокислоты при длине волны 400 нм и установлено её подчинение закону светопоглощения Бугера - Ламберта - Бера (рис. 10). | ||
− | + | ||
+ | Рис 10. Калибровочный график продукта реакции глицина | ||
На рис. 10 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт реакции глицина с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО при длине волны 400 нм подчиняется закону светопоглощения в концентрации глицина от 0,03 до 0,19 мг/мл. | На рис. 10 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт реакции глицина с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО при длине волны 400 нм подчиняется закону светопоглощения в концентрации глицина от 0,03 до 0,19 мг/мл. | ||
Строка 505: | Строка 522: | ||
<table cellpadding="7" border="1"> | <table cellpadding="7" border="1"> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
− | <p>№ п/п</p></td><td> | + | <p>№</p> |
+ | <p>п/п</p></td><td> | ||
<p>Длина волны, нм</p></td><td> | <p>Длина волны, нм</p></td><td> | ||
<p>Значение оптической плотности</p></td></tr> | <p>Значение оптической плотности</p></td></tr> | ||
Строка 527: | Строка 545: | ||
Для качественного и количественного анализа а-аминокислот достаточно часто используют водный раствор нингидрина [7, 13, 20]. На этом основании нами исследованы спектральные характеристики 0,2 % водного раствора нингидрина после его нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин и установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220-300 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм (рис. 11). | Для качественного и количественного анализа а-аминокислот достаточно часто используют водный раствор нингидрина [7, 13, 20]. На этом основании нами исследованы спектральные характеристики 0,2 % водного раствора нингидрина после его нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин и установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220-300 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм (рис. 11). | ||
− | + | ||
+ | Рис 11. Спектр поглощения водного раствора нингидрина после нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин | ||
Учитывая, что вода является наиболее доступным и безопасным растворителем, наиболее целесообразно проводить спектрофотометрическое исследование продуктов реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина в видимой области спектра в диапазоне длин волн - от 400 до 600 нм. | Учитывая, что вода является наиболее доступным и безопасным растворителем, наиболее целесообразно проводить спектрофотометрическое исследование продуктов реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина в видимой области спектра в диапазоне длин волн - от 400 до 600 нм. | ||
Строка 536: | Строка 555: | ||
Исключение составляют продукты реакции с цистеином, пролином и гистидином. Продукт реакции с цистеином характеризуется низкой интенсивностью поглощения в видимой области и имеет максимум при длине волны 450 нм. Пролин -единственная о-аминокислота, в структуре которой отсутствует первичная аминогруппа, этим объясняется отсутствие характерного (при 400 нм) максимума поглощения в видимой области спектра. Однако в диапазоне 395-402 нм отмечается четкое плечо с достаточно интенсивным поглощением. Продукт реакции с гистидином имеет недостаточную интенсивность поглощения в видимой области спектра. Важно отметить, что большинство продуктов реакции характеризуются единым максимумом поглощения при 400 нм (рис. 12-15). | Исключение составляют продукты реакции с цистеином, пролином и гистидином. Продукт реакции с цистеином характеризуется низкой интенсивностью поглощения в видимой области и имеет максимум при длине волны 450 нм. Пролин -единственная о-аминокислота, в структуре которой отсутствует первичная аминогруппа, этим объясняется отсутствие характерного (при 400 нм) максимума поглощения в видимой области спектра. Однако в диапазоне 395-402 нм отмечается четкое плечо с достаточно интенсивным поглощением. Продукт реакции с гистидином имеет недостаточную интенсивность поглощения в видимой области спектра. Важно отметить, что большинство продуктов реакции характеризуются единым максимумом поглощения при 400 нм (рис. 12-15). | ||
− | |||
− | + | Рис 12. Спектры поглощения продуктов реакции о-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина | |
+ | |||
+ | Рис 13. Спектры поглощения продуктов реакции о-аминокислот 0,2 % водным раствором нингидрина | ||
− | + | Рис 14. Спектры поглощения продуктов реакции о-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина | |
− | + | Рис 15. Спектры поглощения продуктов реакции о;-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина | |
Таким образом, наиболее целесообразно проводить реакцию с использованием водного раствора нингидрина с последующим определением оптической плотности её продукта при длине волны 400 нм. | Таким образом, наиболее целесообразно проводить реакцию с использованием водного раствора нингидрина с последующим определением оптической плотности её продукта при длине волны 400 нм. | ||
Строка 560: | Строка 580: | ||
<table cellpadding="7" border="1"> | <table cellpadding="7" border="1"> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
− | <p>№ п/п</p></td><td colspan="3"> | + | <p>№</p> |
+ | <p>п/п</p></td><td colspan="3"> | ||
<p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td> | <p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td> | ||
<p>Разведени</p> | <p>Разведени</p> | ||
<p>е</p></td><td colspan="2"> | <p>е</p></td><td colspan="2"> | ||
− | <p>Оптическая плотность продукта при | + | <p>Оптическая плотность продукта при Х=400 нм</p></td></tr> |
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p></p></td><td> | <p></p></td><td> | ||
− | <p>Навеска глицина, г</p></td><td> | + | <p>Навеска</p> |
+ | <p>глицина,</p> | ||
+ | <p>г</p></td><td> | ||
<p>Объем раствора глицина, мл</p></td><td> | <p>Объем раствора глицина, мл</p></td><td> | ||
<p>Объем 0,2 % водного раствора нингидрина, мл</p></td><td> | <p>Объем 0,2 % водного раствора нингидрина, мл</p></td><td> | ||
Строка 689: | Строка 712: | ||
<table cellpadding="7" border="1"> | <table cellpadding="7" border="1"> | ||
<tr><td rowspan="2"> | <tr><td rowspan="2"> | ||
− | <p>№ п/п</p></td><td rowspan="2"> | + | <p>№</p> |
− | <p> | + | <p>п/п</p></td><td rowspan="2"> |
− | <p> | + | <p>Температур ный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2"> |
− | <p>Разведение продукта реакции водой</p></td><td colspan="2"> | + | <p>Продолжитель ность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2"> |
− | <p>Оптическая плотность продукта при | + | <p>Разведение</p> |
+ | <p>продукта</p> | ||
+ | <p>реакции</p> | ||
+ | <p>водой</p></td><td colspan="2"> | ||
+ | <p>Оптическая плотность продукта при Х=400 нм</p></td></tr> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td> | <p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td> | ||
Строка 725: | Строка 752: | ||
<p>0,39667</p></td><td> | <p>0,39667</p></td><td> | ||
<p>1</p></td></tr> | <p>1</p></td></tr> | ||
+ | </table> | ||
+ | <p>Продолжение табл. 8</p> | ||
+ | <table border="1"> | ||
<tr><td> | <tr><td> | ||
<p>5</p></td><td> | <p>5</p></td><td> | ||
Строка 803: | Строка 833: | ||
На основании оптимизированных условий проведения реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина нами была изучена зависимость светопоглощения продукта реакции от концентрации о-аминокислоты при длине волны 400 нм (рис. 16). | На основании оптимизированных условий проведения реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина нами была изучена зависимость светопоглощения продукта реакции от концентрации о-аминокислоты при длине волны 400 нм (рис. 16). | ||
− | + | ||
+ | Рис 16. Калибровочный график продукта реакции глицина | ||
На рис. 16 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия глицина с 0,2 % водным раствором нингидрина подчиняется закону светопоглощения в концентрации от 0,005 до 0,025 мг/мл. | На рис. 16 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия глицина с 0,2 % водным раствором нингидрина подчиняется закону светопоглощения в концентрации от 0,005 до 0,025 мг/мл. | ||
Строка 809: | Строка 840: | ||
== Заключение == | == Заключение == | ||
− | Таким образом, на основании исследования спектральных характеристик продуктов реакции | + | Таким образом, на основании исследования спектральных характеристик продуктов реакции f-аминокислот с нингидрином в различных растворителях установлены единые максимумы поглощения для большинства а-аминокислот: в УФ- (в диапазоне длин волн 220-260 нм) и видимой областях спектра (при длине волны 400±2 нм, а также в диапазоне длин волн 560-570 нм). |
Оптимизация условий проведения нингидриновой реакции показала, что продукты реакции а-аминокислот с водным раствором нингидрина характеризуются наибольшей стабильностью во времени и имеют единый максимум поглощения при длине волны 400±2 нм. Поэтому, наиболее целесообразно проводить нингидриновую реакцию с водным раствором нингидрина, с последующим спектрофотометрическим определением продуктов при длине волны 400 нм. | Оптимизация условий проведения нингидриновой реакции показала, что продукты реакции а-аминокислот с водным раствором нингидрина характеризуются наибольшей стабильностью во времени и имеют единый максимум поглощения при длине волны 400±2 нм. Поэтому, наиболее целесообразно проводить нингидриновую реакцию с водным раствором нингидрина, с последующим спектрофотометрическим определением продуктов при длине волны 400 нм. | ||
На этом основании разработаны методы количественного определения а-аминокислот в лекарственных препаратах и растительном сырье, основанные на реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина. Разработанные методы отличаются достаточной точностью (относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %) и доступностью. | На этом основании разработаны методы количественного определения а-аминокислот в лекарственных препаратах и растительном сырье, основанные на реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина. Разработанные методы отличаются достаточной точностью (относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %) и доступностью. | ||
− | |||
− | |||
− | |||
− | |||
− | |||
− | |||
== Список литературы == | == Список литературы == | ||
Строка 883: | Строка 908: | ||
30. Kuryt T. Quantitative analysis of amino acids in biological fluids by gas chromatography with flame ionization detection / T. Kuryt, D. Sawnor-Corszynska // Acta chromatogr. - 2000. - № 10. - P. 97-103. | 30. Kuryt T. Quantitative analysis of amino acids in biological fluids by gas chromatography with flame ionization detection / T. Kuryt, D. Sawnor-Corszynska // Acta chromatogr. - 2000. - № 10. - P. 97-103. | ||
− | 31. Yu Hong. Определение аминокислот и глюкозы в аминокислотных инъекционных растворах методом анионообменной хроматографии с интегрированным импульсным амперометрическим детектированием | + | 31. Yu Hong. Определение аминокислот и глюкозы в аминокислотных инъекционных растворах методом анионообменной хроматографии с интегрированным импульсным амперометрическим детектированием |
+ | |||
+ | *[[Количественное определение глицина в таблетках]] | ||
+ | *[[Количественное определение белка в продуктах]] |