Эктопический синтез белков (генотерапия)

Источник:
Клиническая фармакология по Гудману и Гилману том 1.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.

Эктопический синтез белков

Недостаток ростовых факторов и пептидных гормонов в крови можно компенсировать путем эктопической экспрессии соответствующих генов. Этот подход требует доставки генов в ткани, которые в норме не синтезируют этот белок. В экспериментах и в первых клинических испытаниях таким способом удалось добиться экспрессии факторов свертывания (факторов VIII и IX), факторов роста (ИФР-1, эритропоэтина) и пептидных гормонов (СТГ, соматолиберина). В одних случаях необходима постоянная эктопическая секреция белка (например, фактора IX), в других — ген должен находиться под жестким контролем (например, ген эритропоэтина).

Чаще всего для эктопического синтеза белка используют скелетные мышцы (MacColl et al., 1999). Эта ткань обладает большой и постоянной клеточной массой, в нее легко делать инъекции. В нескольких доклинических исследованиях с помощью вирусных векторов и невирусных способов доставки генов удалось добиться трансфекции клеток скелетных мышц при незначительном побочном действии.

Метод эктопического синтеза белка имеет много преимуществ. В целом этот подход более дешев и удобен, чем введение рекомбинантных белков или концентратов, полученных из плазмы. При эктопическом синтезе существенно снижается риск инфекций, передающихся с кровью (таких, как гепатиты и ВИЧ-инфекция), что важно, например, для лечения гемофилии. В экспериментах этот подход был успешно применен для лечения гемофилии, карликовости и хронической анемии (см. ниже).

Фактор IX

Причиной гемофилий А и В является недостаточность факторов VIII и IX соответственно. Исследования, проведенные на мышах и собаках с гемофилией, показали, что трансфекция с помощью аденоассоциированного вектора приводит к устойчивому синтезу фактора IX в скелетных мышцах и улучшает состояние животных (Herzog et al., 1999). Описан и первый опыт применения в клинике аденоассоциированного вектора, содержащего ген фактора IX и промотор сверхранних генов цитомегаповируса, для лечения тяжелой гемофилии В (Kay et al., 2000). В этом исследовании обнаружено некоторое увеличение концентрации фактора IX в крови и снижение потребности во введении экзогенного фактора IX в небольшой группе больных. По-видимому, улучшения экспрессии гена можно добиться с помощью других промоторов, например последовательностей, содержащих энхансер и промотор из мышечной ткани (Hagstrom et al., 2000).

Эритропоэтин

Недостаточность эритропоэтина обычно наблюдается при ХПН. Больным, находящимся на диализе, для поддержания достаточного гематокрита необходимы частые инъекции эпоэтинов. Основной недостаток такого лечения — его высокая стоимость. В экспериментах показана возможность индукции эктопического синтеза эритропоэтина в скелетных мышцах (Tripathy et al., 1996) или коже (Klinman et al., 1999). Для этого в/м или внутрикожно вводили плазмидную ДНК или вирусный вектор, содержащие ген эритропоэтина человека и активный промотор, например промотор сверхранних генов цитомегаловируса. У экспериментальных животных на протяжении нескольких месяцев после инъекции были повышены сывороточная концентрация эритропоэтина и гематокрит.

В норме секреция эритропоэтина почками жестко регулируется, поэтому желательно контролировать и эктопический синтез этого белка. Такая система регуляции (рис. 5.6) была разработана на основе искусственного фактора транскрипции, регулируемого сиролимусом (ра-памицином) (Ye et al., 1999). Сиролимус — это иммунодепрессант для приема внутрь (гл. 53), взаимодействующий с двумя белками: РК506-связывающим белком-12 (FKBP12) и РКВР12-рапамицин-ассоциированным белком. Индуцируемая система экспрессии эритропоэтина содержит три молекулярных компонента: 1) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка р65-субъединицы фактора транскрипции NFkB и РКВР12-рапамицин-связывающего участка FKBP12-pa-памицин-ассоциированного белка, 2) химерный белок, состоящий из ДНК-связывающего участка и FKBP12, и 3) трансген, экспрессия которого регулируется искусственным фактором транскрипции. Сиролимус взаимодействует с FKBP12 и с РКВР12-рапамицин-связывающим участком и тем самым связывает первый химерный белок со вторым — образуется активный фактор транскрипции, который дозозависимо стимулирует экспрессию трансгена. Синтез эритропоэтина в скелетных мышцах происходит только в присутствии сиролимуса, который можно принимать внутрь. Этот подход использовали в экспериментах на мышах с нормальным иммунитетом и на макаках-резус, которым в/м вводили два адено-ассоциированных вектора, кодирующих различные компоненты системы.

Рисунок 5.6. Регуляция экспрессии гена с помощью сиролимуса (рапамицина). В верхней части рисунка показаны: 1) вектор, содержащий нужный трансген, транскрипция которого контролируется промотором, 2) химерный белок, состоящий из ДН К-связывающего участка фактора транскрипции и FKBP12 (см. текст), 3) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка фактора транскрипции и FKBP12-pana-мицин-связывающего участка РКВР12-рапамицин-ассоцииро-ванного белка (см. текст), 4) сиролимус. Сиролимус обеспечивает сборку фактора транскрипции, который активирует РНК-по-лимеразу и запускает транскрипцию. FRB — РКВР12-рапами-цин-связывающий участок РКВР12-рапамицин-ассоциирован-ного белка.

Другие факторы роста и гормоны

Продолжительную регулируемую экспрессию человеческого СТГ удалось получить у мышей после в/м инъекции аденоассоциированного вектора, содержащего соответствующий ген (Rivera et al., 1999). В этих экспериментах использовали регулируемую сиролимусом систему, описанную выше. Сиролимус вызывал значительное дозозависимое повышение концентрации человеческого СТГ в сыворотке мышей примерно через 3 ч после инъекции. Эта концентрация достигала максимума примерно через сутки. Эктопический синтез соматолиберина в мышцах был получен у свиней после в/м инъекции плазмидной ДНК, кодирующей этот пептид под контролем промотора а-актина из скелетных мышц (Draghia-Akli etal., 1997; Draghia-Akli et al., 1999).

В клетках скелетных мышц был получен также эктопический синтез ИФР-1, необходимого для развития этих мышц и других тканей. У мышей в/м инъекция аденоассоциированного вектора, содержавшего ген ИФР-1, приводила к стойкому (на протяжении 27 мес) увеличению мышечной массы и мышечной силы (Barton-Davis et al., 1998). Инъекция препятствовала возрастным изменениям мышечной ткани, что в перспективе позволит использовать этот метод для предотвращения преждевременного старения мышц.