Гормон инсулин

Источник:
Клиническая фармакология по Гудману и Гилману, том 4.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.

Инсулин, пероральные сахаропонижающие средства, глюкагон и соматостатин

Эта статья посвящена фармакологическому действию инсулина, глюкагона, соматостатина и пероральных сахаропонижающих средств. Открытие инсулина в 1921 г. произвело переворот в медицине, дав средство для лечения инсулинозависимого сахарного диабета (сахарного диабета типа I) — болезни, которая считалась неизлечимой. В первой части главы описаны физиологические эффекты инсулина и механизмы его действия; тем самым обоснована роль этого гормона в лечении сахарного диабета. В следующей части дана фармакодинамика и фармакокинетика препаратов инсулина, рассмотрены преимущества интенсивной инсулинотерапии и ее роль в предупреждении хронических осложнений сахарного диабета. Далее описаны фармакологические свойства пероральных сахаропонижающих средств, без которых немыслимо лечение инсулинонезависимого сахарного диабета (сахарного диабета типа II) — самой распространенной формы заболевания. В конце главы рассказывается о физиологии и фармакологии глюкагона и соматостатина. Особое внимание уделено все более широкому применению аналогов соматостатина в клинической практике.

Инсулин

Историческая справка

Открытие инсулина — одно из самых ярких в медицине. Честь открытия принадлежит Бантингу и Бесту, но без предшествующих трудов многих исследователей оно было бы немыслимым. В 1869 г. немецкий студент-медик Пауль Лангерганс обратил внимание, что поджелудочная железа состоит из двух групп клеток — ацинозных, секретируюших пищеварительные ферменты, и иных, собранных в так называемые островки. Лангерганс предположил, что островковые клетки выполняют какую-то особую функцию. О том, какова эта функция, догадались только в 1889 г., когда Оскар Минковски и Йозеф фон Меринг описали у подвергнутых панкреатэктомии собак синдром, похожий на сахарный диабет (Minkowski, 1989).

Затем последовало множество попыток выделить из поджелудочной железы вещество, регулирующее уровень глюкозы в крови. В начале 1900-х гг. немецкий терапевт Георг Людвиг Цюльцер решился ввести вытяжку из поджелудочной железы умирающему от сахарного диабета больному. Больному стало лучше, но ненадолго: когда запасы вытяжки закончились, он впал в кому и скончался. Еще одна попытка найти антидиабетический фактор была предпринята в 1911 г. Э. Л. Скоттом, студентом Чикагского университета. Он лечил собак с экспериментальным сахарным диабетом с помощью спиртового экстракта поджелудочной железы (кстати, почти такого же, какой впоследствии использовали Бантинг и Бест). Однако научный руководитель Скотта счел эти эксперименты неубедительными, поскольку тот не проводил измерений уровня глюкозы в крови. С 1916 по 1920 г. румынский физиолог Николае Паулеску поставил серию опытов, в которых показал, что введение вытяжки из поджелудочной железы собакам с экспериментальным сахарным диабетом снижает содержание глюкозы и кетоновых тел в моче. Несмотря на то что эти результаты были опубликованы, работу Паулеску оценили по достоинству только много лет спустя.

Не подозревая о работах своих предшественников, молодой канадский хирург из Торонто Фредерик Г. Бантингв 1921г.упросил профессора физиологии Джона Дж. Р. Маклеода пустить его в лабораторию для выделения антидиабетического фактора из поджелудочной железы. Бантинг предположил, что секретируемый островковыми клетками гормон (инсулин) быстро разрушается протеазами — во время экстракции или еще до нее. Вместе с Чарльзом Г. Бестом, студентом-медиком четвертого курса, он стал перевязывать протоки поджелудочной железы чтобы избежать протеолиза. После перевязки ацинозные клетки подвергались дегенерации, а островки оставались интактны-ми, и из них с помощью этанола и кислоты был экстрагирован антидиабетический фактор. Полученный экстракт снижал уровень глюкозы в крови у собак с экспериментальным сахарным диабетом.

Первым больным, получившим экстракт Бантинга и Беста, был четырнадцатилетний Леонард Томпсон (Banting et al., 1922), госпитализированный в Торонтскую городскую больницу с уровнем глюкозы в крови 500 мг% (28 ммоль/л) и суточным диурезом 3—5 л. Несмотря на строгую диету (450 ккал/сут), глюкозурия нарастала, и без инсулина мальчик бы погиб через несколько месяцев. Пробное введение экстракта поджелудочной железы привело к снижению уровней глюкозы в крови и моче. Тогда исследователи стали вводить мальчику зкстракг ежедневно, вслед за чем последовало немедленное улучшение. Суточная экскреция глюкозы снизилась со 100 до 7,5 г. Кроме того, «мальчик повеселел, окреп и сказал, что чувствует себя значительно лучше». Таким образом, заместительная терапия новым гормоном — инсулином — позволила предотвратить неизбежную смерть от сахарного диабета (Banting et al., 1922). В последующий год Бантинга и Беста преследовали неудачи. Им никак не удавалось добиться воспроизводимости результатов, то есть раз от раза получать акти вн ые экстракты поджелудочной железы. К решению этой проблемы подключился Маклеод, и, кроме того, Бантинг обратился за помощью к Джеймсу Б. Кол-липу — химику, прославившемуся выделением и очисткой адреналина. Вскоре методика экстрагирования была отлажена, и больные в Северной Америке получили возможность лечиться инсулином, выделенным из поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота. В настоящее время сахарный диабет лечат человеческим инсулином, получаемым методами генной инженерии.

В 1923 г., с удивительной быстротой, Бантинг и Маклеод были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине, и сразу же вокруг нее закипели страсти. Бантинг заявил, что свою половину премии он разделит с Бестом. Маклеод поделился с Колл и пом. История открытия инсулина подробно описана Блиссом (Bliss, 1982).

Строение

Несколько лет спустя Абель получил чистый кристаллический инсулин, но аминокислотная последовательность этого гормона была расшифрована Сэнгером только в I960 г. В 1963 г. был синтезирован искусственный инсулин, а в 1972 г. Ходжкин с коллегами установил его пространственную структуру. Инсулин был первым гормоном, который стали определять с помощью РИА (Yalow, 1978).

Бета-клетки островков поджелудочной железы синтезируют инсулин из препроинсулина — одноцепочечного белка-предшественника, состоящего из 110 аминокислотных остатков. После переноса через мембрану шероховатого эндоплазматического ретикулума от препроинсулина отщепляется кислый N-концевой сигнальный пептид из 24 аминокислотных остатков, и образуется проинсулин (рис. 61.1). На этом этапе образуются дисульфидные связи, и молекула приобретает третичную структуру. В аппарате Гольджи от человеческого проинсулина протеазы отщепляют четыре основных аминокислотных остатка и соединительное звено — С-пептид. В результате получаются две пептидные цепи (А и В), вместе составляющие молекулу инсулина. Каждая из цепей содержит по одной дисульфидной связи, между собой они соединены еще двумя. A-цепь обычно содержит 21 аминокислотный остаток, В-цепь — 30; молекулярная масса инсулина равна 5734. Аминокислотная послеловательность инсулина считается консервативной, но в ходе эволюции с ней происходили существенные изменения, отразившиеся на биологической активности и иммуногенности этого гормона (De Meyts, 1994). У большинства видов имеется один ген инсулина, кодирующий один белок. Исключение составляют крысы и мыши, имеющие по два гена инсулина. У них образуются по два инсулина, различающихся двумя аминокислотными остатками В-цепи.

Кристаллическая структура инсулина к настоящему времени изучена с разрешением 0,15 нм. Обе цепи гормона имеют весьма упорядоченную структуру с несколькими а-спиральными участками. По отдельности цепи инсулина биологической активностью не обладают. В растворе инсулин может существовать как мономер, димер или гексамер. Гексамер образуется с участием двух ионов Zn +; полагают, что именно в этой форме инсулин хранится в секреторных гранулах β-клеток. По-видимому, Zn + играет ведущую роль в формировании кристаллов инсулина, а кристаллизация ускоряет процесс превращения проинсулина в инсулин и облегчает хранение гормона. Большинство препаратов инсулина содержат высококонцентрированный раствор гексамеров гормона. После того как препарат инсулина всосался и его концентрация упала до физиологической (наномолярной), гормон распадается на мономеры, которые и обладают биологической активностью. В последнее время появились препараты инсулина, содержащие мономеры гормона.

Значительная часть наших знаний о взаимосвязи структуры и активности инсулина получена при изучении инсулинов различных видов животных, а также путем химических модификаций молекулы гормона. Инвариантные аминокислотные остатки (Гли\ Глу\ Глн5, Тир1'*, Асн21 в A-цепи и Вал12, Тир16, Гли23, Фен24, Фен и Тир26 в В-цепи) образуют структуру, которая взаимодействует с рецептором инсулина (рис. 61.2). Некоторые из этих остатков участвуют и в димеризации инсулина (de Meyts, 1994). Лей13 A-цепи и Лей17 В-цепи, по-видимому, формируют второй участок связывания (de Meyts, 1994). Инсулин связывается с N-концевым и С-концевым участками а-субъеди-ницы рецептора. Полагают, что в связывании участвует и богатый цистеином фрагмент а-субъединицы рецептора. Как правило, сродство инсулина к своему рецептору коррелирует со способностью гормона влиять на метаболизм глюкозы. Бычий и свиной инсулины обладают биологической активностью, равной активности человеческого инсулина, инсулин морских свинок значительно менее активен, а некоторые птичьи инсулины по активности превосходят человеческий.

Инсулин входит в семейство пептидов, называемых инсулиноподобными факторами роста — ИФР. Два из них (ИФР-I и ИФР-П) имеют молекулярную массу около 7500 и по структуре сходны с проинсулином (Cohick and Clemmons, 1993). В молекуле ИФР сохранены участки, тождественные С-пептиду проинсулина. В отличие от инсулина, ИФР продуцируются многими тканями и участвуют в первую очередь в регуляции роста, а не метаболизма. Полагают, что эти пептиды, особенно ИФР-1, опосредуют действие СТГ (раньше их даже называли соматомединами). Не исключено, что релаксин — гормон, секретируемый желтым телом во время беременности, находится в отдаленном родстве с ИФР.

Рецепторы инсулина и ИФР-I тоже сходны по структуре (Duronio and Jacobs, 1988). Поэтому инсулин хоть и с низким сродством, но связывается с рецептором ИФР-I, а ИФР-1 — с рецептором инсулина. Полагают, что стимулирующее действие инсулина на пролиферацию клеток, по крайней мере отчасти, опосредовано рецептором ИФР-I. Метаболическая и митогенная активность аналогов инсулина не всегда коррелируют. Например, метаболическая активность проинсулина в 50 раз меньше, чем инсулина, а митогенная — всего в 2 раза меньше (King and Kahn, 1981). Это нужно учитывать при выборе препарата инсулина, поскольку стимулирующее действие на пролиферацию клеток повышает риск атеросклероза.

Рисунок 61.1. Человеческий проинсулин и его превращение в инсулин. Показана аминокислотная последовательность человеческого инсулина. Под действием протеаз от проинсулина отщепляются четыре основных аминокислотных остатка (31, 32, 64 и 65-й) и соединительное звено — С-пептид. Показаны места действия прогормон-конвертаз 2 и 3 (ПГК2 и ПГКЗ).

Метаболизм инсулина

Синтез и секреция

Синтез, запасание и секреция инсулина β-клетками, а также инактивация гормона в тканях-мишенях подробно изучены на клеточном и молекулярном уровнях. Более того, эти сведения послужили основой для изучения секреторной активности других островковых клеток (Orci, 1986). Островки поджелудочной железы содержат клетки четырех типов, которые синтезируют и секретируют разные пептидные гормоны: β-клетки — инсулин, а-клетки — глюкагон, 5-клетки — соматостатин, а РР-клетки (они же F-клетки) — панкреатический полипептид. На долю β-клеток приходится 60—80% массы островка, они составляют его ядро. Альфа-, 8- и РР-клетки формируют вокруг ядра мантию толщиной в 1—3 клетки.

Островковые клетки соединены между собой щелевыми контактами, которые пропускают небольшие молекулы и обеспечивают координацию работы клеток (Orci, 1986). Артериола, входя в островок, ветвится и образует в его ядре похожую на клубочек капиллярную структуру. Капилляры выходят в мантию и сливаются там в собирательный сегмент венулы (Вопner-Weir and Orci, 1982). Кровь в островке течет от р-клеток к а-и 5-клеткам (Samols et al., 1986). Таким образом, β-клетки первыми воспринимают концентрацию глюкозы в крови, а остальные типы клеток подвергаются действию чрезвычайно высоких концентраций инсулина.

Как уже говорилось, инсулин образуется из одноцепочечного предшественника, в котором А- и В-цепи соединены С-пеп-тидом. В процессе трансляции возникает препроинсулин, содержащий дополнительно сигнальную последовательность из 24 гидрофобных аминокислотных остатков на N-конце В-цепи. Сигнальная последовательность нужна для проникновения образующегося препроинсулина в просвет шероховатого эндо-плазматического ретикулума, где сигнальная последовательность сразу же отщепляется, а проинсулин в мелких везикулах транспортируется в аппарат Гольджи. Здесь он упаковывается в секреторные гранулы вместе с ферментами, необходимыми для его превращения в инсулин (Orci, 1986).

Превращение проинсулина в инсулин начинается в аппарате Голыши и продолжается в секреторных гранулах, практически завершаясь к моменту секреции. Таким образом, в кровоток попадают эквимолярные количества С-пептида и инсулина. Какие биологические функции выполняет С-пептид, пока не известно, однако он служит надежным маркером секреции инсулина (Polonsky and Rubenstein, 1986). Кроме того, из β-клеток высвобождаются малые количества проинсулина и дез-31,32-проинсулина. Это может объясняться либо экзоцитозом гранул, в которых превращение проинсулина в инсулин еще не завершилось, либо наличием дополнительного механизма секреции. Поскольку Я проинсулина в кровотоке намного больше, чем Т1/2 инсулина, до 20% иммунореактивного инсулина плазмы на самом деле представляют собой проинсулин и промежуточные продукты его превращения в инсулин.

Рисунок 61.2. Пространственная структура инсулина. Заштрихованная область соответствует участку связывания с рецептором. Pullen etal., 1976.

Превращение проинсулина в инсулин осуществляют две Са2+-зависимые эндопептидазы, обнаруженные в секреторных гранулах островковых и других нейроэндокринных клеток. Эти эндопептидазы — прогормон-конвертазы 2 и 3 — имеют активный центр, сходный с таковым субтилизина, и расщепляют связи Лиз—Apr и Apr—Apr (Steiner et al., 1992). Прогормон-конвертаза 2 расщепляет только место соединения С-пептида с A-цепью. Прогормон-конвертаза 3 расщепляет преимущественно место соединения С-пептида с В-цепью, но может также действовать на точку приложения прогормон-конвертазы 2. Хотя данное семейство эндопротеаз включает в себя как минимум еще два белка (прогормон-конвертазу 1 и фурин), за превращение проинсулина в инсулин ответственны, очевидно, только прогормон-конвертазы 2 и 3.

Регуляция секреции

Секреция инсулина регулируется настолько четко и слаженно, что и натощак, и во время еды в крови поддерживается постоянный уровень глюкозы. В регуляции участвуют питательные вещества, гормоны, вырабатываемые поджелудочной железой и ЖКТ, а также медиаторы вегетативной нервной системы. Глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты и кетоновые тела стимулируют секрецию инсулина. Островки поджелудочной железы имеют богатую адренергическую и холинергическую иннервацию. Стимуляция а2-адренореиепторов ведет к подавлению секреции инсулина, а стимуляция β2-адре-норецепторов и блуждающего нерва — к усилению. Любое воздействие, повышающее симпатический тонус (гипоксия, переохлаждение, хирургическое вмешательство, ожоги), сопровождается снижением секреции инсулина за счет активации а2-адренорецепторов. Соответственно, а2-адреноблокаторы увеличивают базальный уровень инсулина в плазме, а β2-адреноблокаторы уменьшают его (Porte and Halter, 1981).

Главным стимулятором секреции инсулина служит глюкоза, ее присутствие необходимо и для действия других стимуляторов (Matschinsky, 1996). Глюкоза сильнее стимулирует секрецию инсулина, когда ее принимают внутрь, чем при в/в введении. Действительно, прием пиши (и в ее составе — глюкозы) ведет к выбросу гормонов ЖКТ и активации блуждающего нерва (Malaisse, 1986; Brelje and Sorenson, 1988). Среди гормонов ЖКТ, стимулирующих секрецию инсулина, ведущая роль принадлежит гастроингибирующему пептиду и глюкагоноподобному пептиду типа 1; менее сильные стимуляторы — гастрин, секретин, хо-лецистокинин, ВИП, гастрин-высвобождающий пептид и оксинтомодулин (Ebert and Creutzfeldt, 1987).

Секреция инсулина, возникающая под действием глюкозы, носит двухфазный характер. Первая фаза достигает максимума через I —2 мин и длится недолго, вторая начинается не сразу, но продолжается длительное время. Механизм, посредством которого глюкоза вызывает секрецию инсулина, до конца не изучен. Первым делом глюкоза должна попасть внутрь β-клеток и метаболизироваться (Matschinsky, 1996).

Глюкоза транспортируется в β-клетки путем облегченной диффузии, в которой участвует мембранный белок — переносчик глюкозы GLUT2 (см. ниже). Внутри клеток глюкоза фосфорилирустся глюкокиназой. В отличие от других гексокиназ, глюкокиназа (гексокиназа типа IV) экспрессируется только в тех клетках, которые участвуют в регуляции метаболизма глюкозы, в частности в гепатоцитах и β-клетках островков поджелудочной железы. Благодаря довольно высокой константе Михаэлиса (10—20 ммоль/л) этот фермент играет важнейшую роль в поддержании нормальной концентрации глюкозы в организме. Способность моно- и дисахаридов подвергаться фосфори-лированию и, следовательно, гликолизу коррелирует с их способностью стимулировать секрецию инсулина. Этот факт позволил предположить, что на самом деле стимулятором секреции инсулина является некий промежуточный продукт гликолиза либо какой-то кофермент (Matschinsky, 1996). Обнаружение мутаций гена глюкокиназы у больных с относительно редкой формой сахарного диабета — юношеским инсулинонезависимым сахарным диабетом типа 2 (MODY2; см. ниже) упрочило гипотезу о том, что глюкокиназа служит своеобразным датчиком концентрации глюкозы. Данные мутации приводят к нарушению способности глюкокиназы фосфорилировать глюкозу и таким образом увеличивают минимальную концентрацию глюкозы, при которой усиливается секреция инсулина (Gidh-Jain et al., 1993).

В конечном счете скорость секреции инсулина определяется внутриклеточной концентрацией Са2+ (Wolfet al., 1988). Метазолизм глюкозы, который начинается с фосфорилирования глюкокиназой, приводит к уменьшению отношения концентраций АТФ и АДФ в клетке. В результате ингибируются АТФ-чувст-вительные калиевые каналы и мембрана β-клетки деполяризуется. Последующее открывание потенциалзависимых кальциевых каналов приводит ко входу Са2+ в клетку. Кальций активирует фосфолипазы А2 и С, и в результате образуются арахидоно-вая кислота, инозитолполифосфаты и ДАГ. ИФ3 способствует мобилизации Са2+ из структур, подобных эндоплазматическому ретикулуму, что вызывает дальнейший подъем внутриклеточной концентрации Са . Ионы кальция непосредственно стимулируют секрецию инсулина.

Подъем внутриклеточной концентрации Са наблюдается также при активации фосфолипазы С ацетилхолином, холецистокинином и гормонами, увеличивающими внутриклеточную концентрацию цАМФ (Ebert and Creutzfeldt, 1987). Глюкагон, гастроингибирующий пептид и глюкагоноподобный пептид типа 1 активируют аденилатциклазу β-клеток (фермент, под действием которого образуется цАМФ), а соматостатин и а2-адреностимуляторы ингибируют ее (Fleischer and Erlichman, 1989).

Большинство питательных веществ и гормонов, стимулирующих секрецию инсулина, усиливают и биосинтез этого гормона (Gold et al., 1982). Хотя синтез и секреция инсулина тесно связаны между собой, существуют факторы, которые влияют на один процесс, не затрагивая другой. Примером может служить снижение внутриклеточной концентрации Са2+, которое ингибирует секрецию, но не влияет на синтез инсулина.

Скорости секреции инсулина и глюкагона осгровковыми клетками обычно находятся в обратной зависимости друг от друга (Unger, 1985). Это связано с действием на а-клетки инсулина, а также глюкозы и других веществ (см. ниже). Кроме того, секрецию и инсулина, и глюкагона модулирует соматостатин — третий островковый гормон (см. ниже). Глюкагон вызывает выброс соматостатина, а соматостатин подавляет секрецию инсулина, что в физиологических условиях большой роли не играет. Кровь в островках течет от р-клеточного ядра к а- и 5-клеткам (Samols et al., 1986), поэтому инсулин может паракринно ингибировать секрецию глюкагона, а вот соматостатин, чтобы попасть к а- и β-клеткам, должен пройти оба круга кровообращения. Таким образом, инсулин регулирует секрецию глюкагона и панкреатического полипептида, тогда как роль соматосгатина остается неясной.

Распределение и инактивация

В крови инсулин находится в виде ни с чем не связанного мономера, и его объем распределения приближается к объему внеклеточной жидкости. Натощак из поджелудочной железы в воротную вену поступает около 40 мкг (1 ед) инсулина в час. При этом в воротной вене концентрация инсулина составляет 2—4 нг/мл (50—100 мкед/мл), а в периферической крови — 0,5 нг/мл (12 мкед/мл), или примерно 0,1 нмоль/л. После приема пиши концентрация инсулина в воротной вене быстро возрастает, вслед за чем наблюдается параллельный, но меньший по амплитуде подъем концентрации инсулина в периферической крови. Задача инсулинотерапии — воспроизвести эту картину, однако с помощью п/к инъекций гормона добиться этого очень и очень трудно.

Т1/2 инсулина в плазме у здоровых людей и больных с неосложненным сахарным диабетом составляет 5—6 мин (Sodoyez et al„ 1983). У больных сахарным диабетом, имеющих антитела к инсулину, эта цифра бывает несколько выше. Т,/2 проинсулина дольше и составляет примерно 17 мин; на долю проинсулина приходится около 10% всего иммунореактивного инсулина плазмы (Robbins et al., 1984). У больных с инсулиномой доля проинсулина в крови обычно увеличена и достигает 80% иммунореактивного инсулина плазмы. Поскольку биологическая активность проинсулина составляет около 2% активности инсулина, истинная концентрация гормона всегда несколько ниже той, которую дают неспецифичные РИА и иммуноферментный анализ. С-пептид секретируется вместе с инсулином в эквимолярных количествах, но его молярная концентрация в плазме выше концентрации инсулина — за счет меньшего печеночного клиренса и длительного Т1/2 (около 30 мин) (Robbins et al., 1984). По концентрации С-пептида в крови судят о стимулированной секреции инсулина.

Инактивация инсулина осуществляется преимущественно в печени, почках и мышцах (Duckworth, 1988). Примерно половина инсулина, достигающего печени через воротную вену, разрушается гепатоцитами и не попадает в системный кровоток. Инсулин фильтруется в почечных клубочках и реабсорбируется в почечных канальцах, что тоже приводит к его разрушению. Тяжелая почечная недостаточность влияет на ТЦ инсулина даже в большей степени, чем заболевания печени (Rabkin et al., 1984). Дело в том, что гепатоциты и в норме инактивируют инсулин с максимальной скоростью, поэтому возможности скомпенсировать утраченную функцию почек у них нет. Прием глюкозы внутрь, похоже, приводит к снижению поглощения инсулина печенью (Hanks et al.,1984). Периферические ткани, в частности жировая, тоже инактивируют инсулин, но в малых количествах.

Протеолиз инсулина в печени происходит главным образом внутри гепатоцитов (после интернализации гормон-рецепторного комплекса), и лишь малая часть инсулина расщепляется на поверхности клеток (Berman et al., 1980). Интернализация гормон-рецепторного комплекса осуществляется путем эндоцитоза, во время которого комплекс попадает в мелкие везикулы, называемые эндо-сомами. В них и начинается разрушение инсулина (Duckworth, 1988). Некоторое количество гормона разрушается в лизосомах.

Доля инсулина, разрушаемого после интернализации, зависит от типа клеток. Так, в гепатоцитах расщепляется более 50% попавшего внутрь клеток инсулина, а эндотелиальные клетки высвобождают неизмененным почти весь поглощенный ими гормон. По-видимому, инсулин просто транспортируется эндотелиальными клетками из крови во внеклеточное пространство (King and Johnson,1985). Там, где эндотелиальные клетки соединены между собой плотными контактами (в частности, в мышечной и жировой ткани), такой транспорт, называемый трансцитозом, играет важнейшую роль в доставке инсулина к клеткам-мишеням.

В расщеплении инсулина участвуют несколько ферментов. Главный из них — цистеиновая металлопротеиназа, содержащаяся в гепатоцитах (Shii and Roth, 1986). Иммунологически сходные с ней белки обнаружены в мышцах, почках и головном мозге (Duckworth, 1988). Наибольшую активность по расщеплению инсулина проявляет цитозоль, поэтому возникает вопрос, каким же образом цитозольный фермент действует на заключенный в везикулы инсулин. В то же время эта активность обнаружена и в эндосомах (Hamel et al., 1991). Описан и другой фермент, расщепляющий инсулин (Authieret al., 1994). Распределение ролей между двумя ферментами остается под вопросом. Не исключено, что оба они участвуют в инактивации и других гормонов, в частности глюкагона.

Механизмы действия инсулина

Действие на клетки

Инсулин обладает целым спектром биологических эффектов. Его главными мишенями служат печень, мышцы и жировая ткань, играющие ведущую роль в обмене глюкозы, однако инсулин влияет и на многие другие ткани. Это важнейший гормон, ответственный за транспорт, метаболизм и запасание клетками питательных веществ: он стимулирует анаболические процессы (утилизацию и запасание глюкозы, аминокислот и жирных кислот) и тормозит катаболические (распад гликогена, жиров и белков). Под действием инсулина стимулируется транспорт питательных веществ и ионов внутрь клетки, ускоряется внутриклеточное перемещение белков, активируются или инактивируются ферменты, изменяется количество белков путем изменения скорости транскрипции их генов и трансляции мРНК (рис. 61.3,61.4).

Рисунок 61.3. Молекулярные механизмы действия инсулина. Связывание инсулина со своим рецептором на клеточной мембране запускает каскад внутриклеточных реакций. Первым в цепи событий становится аутофосфорилирование рецептора по остаткам тирозина и фосфорилирование по тирозину других внутриклеточных белков (Тир -» Тир-Ф) благодаря собственной тирозинкиназной активности рецептора. Это приводит к активации многих внутриклеточных ферментов, участвующих в реализации метаболических эффектов инсулина, в том числе ГТФаз, протеинкиназ и киназ липидов. На рисунке показаны два наиболее изученных пути внутриклеточной передачи сигнала инсулина. Первый сводится к фосфорилированию белка IRS-2 с последующей активацией фосфагидилинозитол-3-киназы (одной из киназ липидов) и фосфоинозитилной системы. Вновь образующиеся фосфоинозитиды служат вторыми посредниками, активируя, в свою очередь, многие внутриклеточные реакции, на сегодняшний день еще плохо изученные (в частности, протекающие с участием киназы р70“). Второй путь — фосфорилирование белка IRS-1 — приводит к активации малого G-белка (Ras) и запуску каскада митоген-активируемых протеинкиназ. Этот каскад завершается активацией митоген-активируемой протеинкиназы р42/р44, играющей важнейшую роль в регуляции пролиферации и дифферениировки многих клеток. Каждый из двух путей влияет на множество физиологических процессов. Grb2 — адаптерный белок, IRS — белки — субстраты рецептора инсулина, МАР — митоген-активируемая протеинкиназа, МЕК — киназа митоген-активируемой протеинкиназы и киназа ERK, МАРКАР-К2 — протеинкиназа-2, активируемая митоген-активируемой протеинкиназой, р70м и р90"* — киназы рибосомного белка S6, She — адаптерный белок, SOS — фактор обмена гуаниновых нуклеотидов. Granner, 2000.

Некоторые эффекты инсулина проявляются в течение нескольких секунд или минут; среди них — стимуляция транспорта глюкозы и ионов, фосфорилирование и де-фосфорилирование ферментов, и даже ингибирование транскрипции гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы (Granner, 1987; O’Brien and Granner, 1996). Для достижения других эффектов инсулина, в частности для изменения транскрипции большинства генов и изменения синтеза белка, требуется несколько часов. Эффект инсулина на пролиферацию и дифференцировку клеток проявляется только через несколько суток. Не ясно, обусловлены ли эти временные различия разными механизмами внутриклеточной передачи сигнала или разной кинетикой самих процессов, регулируемых инсулином.

Регуляция транспорта глюкозы

Важнейший физиологический эффект инсулина — стимуляция транспорта глюкозы в мышцах и жировой ткани. Глюкоза проникает в клетки путем облегченной диффузии, которая опосредуется специальными белками — переносчиками глюкозы. Известны пять таких белков (GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4 и GLUT5); считается, что они осуществляют независимый транспорт глюкозы в клетки путем облегченной диффузии (Shepherd and Kahn, 1999). Белки — переносчики глюкозы представляют собой гликопротеиды с молекулярной массой около SO ООО; каждый из них имеет по 12 трансмембранных а-спиральных доменов. Стимуляция инсулином транспорта глюкозы, по крайней мере отчасти, обусловлена энергозависимым перемещением внутриклеточных везикул, содержащих белки GLUT4hGLUTI, к клеточной мембране (Suzuki and Копо, 1980; Simpson and Cushman, 1986; рис. 61.3). Этот эффект обратим: по мере разрушения инсулина белки —переносчики глюкозы возвращаются в свои внутриклеточные хранилища. Полагают, что нарушение данного процесса служит одним из патогенетических звеньев инсулинонезависимого сахарного диабета (Shepherd and Kahn, 1999).

Регуляция метаболизма глюкозы

Облегченная диффузия глюкозы в клетки по градиенту концентрации завершается фосфорилированием глюкозы. Образование глюко-зо-6-фосфата из глюкозы катализируется гексокиназой, четыре изофермента которой, подобно белкам — переносчикам глюкозы, распределены в разных тканях по-разному. Активность двух изоферментов гексокиназы регулируется инсулином. Гексокиназатипа IV, часто называемая глюкокиназой, имеет молекулярную массу 50 ООО и обнаруживается наряду с белком GLUT2 в гепатоцитах и β-клетках. Глюкокиназа кодируется одним геном, но в печени и островках поджелудочной железы при транскрипции этого гена используются разные промоторы и разные первые экзоны (Printz et al., 1993а). Транскрипция гена глюкокиназы в печени регулируется инсулином (Magnuson et al., 1989). Гексокиназа типа II имеет молекулярную массу 100 000; она присутствует в скелетных мышцах, миокарде и жировой ткани вместе с белком GLUT4. Инсулин регулирует транскрипцию и гена белка GLUT4, и гена гексокиназы типа II (Printz et al., 1993b).

Глюкозо-6-фосфат служит общим субстратом для двух метаболических путей. Во-первых, он включается в гликолиз — каскад ферментативных реакций, в результате которого образуется АТФ. Многие из реакций гликолиза усиливаются под действием инсулина: либо за счет регуляции транскрипции генов, кодирующих ферменты, либо за счет фосфорилирования или дефосфорилирования сериновых и треониновых остатков, ведущего к изменению активности ферментов. Во-вторых, глюкозо-6-фосфат может превращаться в глюкозо-1 -фосфат, из которого синтезируется гликоген. Инсулин стимулирует запасание гликогена, активируя гликогенсинтетазу (катализируемая этим ферментом реакция лимитирует скорость гликогенеза) и ингибируя фосфорилазу (катализируемая этим ферментом реакция лимитирует скорость гликогенолиза). Как и в случае гликолиза, эффекты инсулина опосредуются фосфорилированием и дефосфорилированием ферментов; это важнейший механизм действия данного гормона. Например, ацетил-КоА-карбоксилаза и АТФ-цитратлиаза активируются при фосфорилировании, а гликогенсинтетаза и пируватдегидрогеназа — при дефосфорилировании. Дефосфорилирование последних двух ферментов — результат активации инсулином фосфатаз. Подобным образом модифицируются и меняют свою активность десятки белков (Denton, 1986).

Рисунок 61.4. Действие инсулина. Инсулин способствует запасанию глюкозы в виде гликогена а печени и в виде триглицеридов в жировой ткани, а также к запасанию аминокислот в виде белка в мышцах. Кроме того, инсулин стимулирует утилизацию глюкозы мышцами, что приводит к высвобождению энергии. Эти эффекты инсулина усиливаются после еды; на рисунке они показаны черными стрелками. Инсулин подавляет распад триглицеридов, гликогена и белка, а также превращение аминокислот в глюкозу (глюконеогенез). Эти эффекты гормона показаны белыми стрелками. Превращение аминокислот в глюкозу и глюкозы — в жирные кислоты осушесталяется главным образом в печени.

Регуляция транскрипции генов

В настоящее время нет сомнений в том. что важнейшим из эффектов инсулина является регуляция транскрипции тех или иных генов. Примером может служить ингибирование транскрипции гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы (Granner et al., 1983). Этот эффект инсулина проливает свет на механизм торможения им глюконеогенеза (Sasaki et al., 1984) и объясняет, почему при инсулинорезистентности, характерной для инсулинонезависимого сахарного диабета, печень синтезирует избыток глюкозы (Granner and O’Brien, 1992). Известно более 100 генов, транскрипция которых регулируется инсулином (O’Brien and Granner, 1996), и этот список продолжает расти. Однако механизм, посредством которого инсулин влияет на транскрипцию, пока еще не расшифрован.

Рецептор инсулина

Инсулин оказывает свои эффекты, связываясь с мембранным рецептором. У млекопитающих эти рецепторы имеются почти на всех клетках — как на тех, что считаются классическими мишенями инсулина (гепатоцитах, миоцитах и липоцитах), так и на клетках крови, головного мозга и половых желез. Число рецепторов инсулина колеблется от 40 (у эритроцитов) до 300 ООО на клетку (у гепатоцитов и липоцитов).

Рецептор инсулина представляет собой крупный трансмембранный гликопротеид, состоящий из двух а-субъединиц с молекулярной массой 135 ООО (по 719 или 731 аминокислотному остатку в зависимости от сплайсинга мРНК) и двух β-субъединиц с молекулярной массой 95 ООО (по 620 аминокислотных остатков). Субъединицы соединены дисульфидными связями в гетеротетрамер β-а-а-β (рис. 61.3) (Virkamaki et al., 1999). Обе субъединицы образуются из общего одноцепочечного предшественника, в составе которого аминокислотные последовательности а- и β-субъединиц разделены участком, состоящим из четырех основных аминокислотных остатков. Субъединицы рецептора наделены каждая своей функцией. Альфа-субъединицы расположены внеклеточно и содержат инсулинсвязываю-щий домен (см. выше), тогда как β-субъединицы образуют трансмембранный домен, обладающий тирозинкиназной активностью. После связывания инсулина с рецепторами происходит их агрегация и быстрая интернализация гормон-рецепторных комплексов. Поскольку двухвалентные антитела к рецептору инсулина, перекрестно связываясь с соседними рецепторами, имитируют эффект инсулина, а моновалентные антитела этим свойством не обладают, полагают, что агрегация рецепторов необходима для запуска каскада внутриклеточных реакций. После интернализации гормон-рецепторного комплекса рецептор инсулина либо разрушается, либо возвращается обратно в клеточную мембрану.

Фосфорилирование тирозиновых остатков и механизмы внутриклеточной передачи сигнала. Рецептор инсулина обладает собственной тирозинкиназной активностью (Virkamaki et al., 1999). Этим свойством обладают также рецепторы многих факторов роста, например эпидермального фактора роста, тромбоцитар-ного фактора роста и М-КСФ (Yarden and Ullrich, 1988). Знания о механизме передачи сигнала рецепторами с собственной тирозинкиназной активностью получены в основном при изучении белков, кодируемых онкогенами и вызывающих опухолевую трансформацию клеток, в частности тирозинкиназ семейства Src.

При связывании инсулина с а-субъединицами рецептора быстро происходит аутофосфорилирование тирозиновых остатков β-субъединиц. Эта аутокаталитическая реакция приводит к значительному усилению тирозинкиназной активности рецептора в отношении других белков. В нормальных клетках происходит также фосфорилирование сериновых и треониновых остатков рецептора инсулина, в основном под действием проте-инкиназ С и А. Эта последняя реакция ведет к подавлению тирозинкиназной активности рецептора (Cheatham and Kahn, 1995).

Тирозинкиназная активность рецептора необходима для проявления эффекта инсулина. Мутации, которые изменяют АТФ-связывающий центр или приводят к замене тирозиновых остатков, подвергающихся аутофосфорилированию, на другие, ведут к снижению собственной тирозинкиназной активности рецептора инсулина и ослаблению эффектов гормона (Ellis et al., 1986). Рецептор инсулина, не способный к аутофосфорилированию, полностью лишен активности.

Активированный рецептор инсулина запускает каскад внутриклеточных реакций, первой из которых является фосфорилирование четырех белков, называемых субстратами рецептора инсулина, — IRS-1, IRS-2, IRS-3 и IRS-4 (White et al., 1985). После фосфорилирования белок IRS-2 приобретает способность взаимодействовать с другими белками, которые содержат БШ-доме-ны (названные так вследствие гомологии с тирозинкиназой Src). Один из них — фосфатидилинозитол-3-киназа, гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы с молекулярной массой 110 000 (pi 10) и регуляторной субъединицы с молекулярной массой 85 000 (р85). Субъединица р85 содержит два БШ-домена, которые связываются с белком IRS-1. Фосфатидилинози-тол-3-киназа катализирует фосфорилирование фосфоинозити-дов в положении 3 инозитола, а продукты реакции участвуют во внутриклеточной передаче сигнала (фосфоинозитидная система). Фосфатидилинозитол-З-киназа активируется многими гормонами и факторами, которые стимулируют пролиферацию клеток; среди них — тромбоцитарный и эпидермальный факторы роста и ИЛ-4 (Virkamaki et al., 1999). Действие этого фермента на пролиферацию, по-видимому, опосредуется активацией проте-инкиназы В и, возможно, других киназ.

Одни из самых мощных митогенов — белки Ras, кодируемые одноименными онкогенами; они активируют каскад митоген-активируемых протеинкиназ. Об участии белков Ras в опосредовании эффектов инсулина задумались тогда, когда стало известно, что инсулин в числе прочих ферментов активирует и этот каскад (Avruch et al., 1994). Недавно выяснился и механизм этого участия, правда, не до конца. Активация рецепторов с собственной тирозинкиназной активностью, в том числе рецептора инсулина, приводит к взаимодействию еще одного содержащего SH2-домен белка — адаптерного белка Grb2 — с фосфорилированным белком IRS-1. Адагггерный белок Grb2 связывается с фактором обмена гуаниновых нуклеотидов SOS, и этот комплекс увеличивает сродство белков Ras к ГТФ. Активированный белок Ras взаимодействует с белком Raf-1 (серин-треониновой киназой), который, в свою очередь, активирует каскад митоген-активируемых протеинкиназ. Кроме того, активированный рецептор инсулина фосфорилирует содержащий БШ-домен адагггерный белок She, после чего тот связывается с белком Grb2. Это, по-видимому, приводит к усилению взаимодействия фактора обмена гуаниновых нуклеотидов SOS с клеточной мембраной, активации белков Ras и Raf-1 и каскада митоген-активируемых протеинкиназ. Механизм, посредством которого инсулин вызывает пролиферацию клеток, окончательно не установлен, но уже ясно, что в нем задействованы множественные, возможно даже избыточные, пути внутриклеточной передачи сигнала (Avruch et al., 1994).

Метаболическое действие инсулина, по-видимому, опосредуется белком IRS-2. Внутриклеточное перемещение белков — переносчиков глюкозы в мышцах и жировой ткани, ведущее к усилению транспорта глюкозы в клетки, — главный эффект инсулина. Перемещение белков-переносчиков блокируется ворг-маннином, ингибитором фосфатидилинозитол-3-киназы. Действие инсулина на транскрипцию генов ключевых ферментов углеводного обмена тоже блокируется вортманнином, поэтому не исключено, что он опосредуется белком IRS-2 и субстратами фосфатидилинозитол-3-киназы.