Спорт-вики — википедия научного бодибилдинга
NEWS:

Материал из SportWiki энциклопедия
Перейти к: навигация, поиск

Разработка методики количественного определения суммы аминокислот в шроте яблок[править]

Нами изучена возможность использования нингидриновой реакции в количественном анализе суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок. Кроме того, нами проведена оптимизация и оценка количественного содержания а-аминокислот в сырье после кислотного гидролиза.

Приготовление образца 1. 10,0 г сырья (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния шестикратно экстрагируют горячей водой по 1 ч при температуре 80-90 °С (гидромодуль 1:8). Полученные извлечения фильтруют, объединяют, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят водой до метки (далее - исходное извлечение или образец 1).

С целью изучения влияния балластных веществ на количественное содержание суммы а-аминокислот в шроте яблок, нами приготовлено водное извлечение, очищенное от балластных веществ (образец 2).

Образец 2. К 20 мл исходного извлечения (образца 1) добавляют трехкратный объем 96 % этанола для осаждения балластных ВМС и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Нами установлено, что продукты взаимодействия обоих образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина характеризуются высокой стабильностью во времени: за период 1-1,5 ч после начала реакции их интенсивность светопоглощения при длине волны 400 нм снижается на 0,2-0,5 %.

Нами установлено, что из всех изученных а-аминокислот продукт взаимодействия пролина с нингидрином при длине волны 400 нм характеризуется наибольшей стабильностью (за период 1—1,5 ч после начала реакции интенсивность светопоглощения снижается на 0,2 %). На этом основании мы установили предельные концентрации пролина в нингидриновой реакции, подчиняющиеся закону светопоглощения, а именно 0,016-0,072 мг/мл (рис 17).

Рис 17. Калибровочный график продукта реакции пролина

На этом основании и с учетом ранее оптимизированных условий реакции с водным раствором нингидрина нами разработана методика проведения количественного определения а-аминокислот в шроте яблок.

К 1,5 мл исследуемых извлечений (образцы 1 и 2) добавляют 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения отбирают по 2 мл каждого из продуктов реакции и разбавляют их водой: до 10 мл (образец 1) и до 5 мл (образец 2) и спустя 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Параллельно проводят реакцию 1,5 мл свежеприготовленного 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина, после охлаждения отбирают 2 мл продукта реакции, разбавляют его водой до 5 мл и определяют оптическую плотность в аналогичных условиях. Стандартный образец пролина получен многократной дробной кристаллизацией пролина из этанольно-эфирной смеси.

Содержание суммы аминокислот в образцах относительно пролина вычисляют по формуле:

Х=[Dx*mo*100*a*100%]/[Do*mx*(100-W)*b]

Dx - оптическая плотность продуктов реакции исследуемых образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина;

Do - оптическая плотность продукта реакции 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 0,2 % водным раствором нингидрина;

mо и mх- средние массы навесок стандартного образца пролина и шрота яблок, соответственно, г,

W- остаточная влажность шрота яблок (14,9 %);

а и b - разведения продуктов нингидриновой реакции исследуемых образцов и стандартного образца пролина, соответственно, мл.

На основании проведённых для каждого образца шести параллельных испытаний получены результаты, которые приведены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11. Результаты количественного определения суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок.

№ эксперимента

Навеска шрота яблок г

Навеска пролина, г

Оптическая плотность при λ=400 нм продукта реакции

Содержание 1 суммы аминокислот относительно пролина, %

Водного извлечения

Пролина

1

0,030001

0,000249

0,40091

0,52065

1,502

2

0,030004

0,000237

0,42839

0,52149

1,525

3

0,029991

0,000239

0,42524

0,51986

1,532

4

0,029995

0,000241

0,42326

0,51932

1,539

5

0,029989

0,000238

0,43000

0,51911

1,545

6

0,029984

0,000236

0,43435

0,51903

1,548

Таблица 12. Результаты количественного определения суммы свободных a-аминокислот в шроте яблок, очищенном от балластных ВМС.

№ 1 эксперимента

Навеска шрота яблок г

Навеска пролина, г

Оптическая плотность при λ= 400 нм продукта реакции

Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %

Водного извлечения

Пролина

1

0,024000

0,000249

0,46662

0,52000

1,094

2

0,023978

0,000241

0,48768

0,51984

1,108

3

0,023971

0,000239

0,49254

0,51848

1,113

4

0,023985

0,000244

0,48424

0,51824

1,117

5

0,023965

0,000237

0,49895

0,51817

1,119

6

0,023992

0,000245

0,48454

0,51821

1,122

Анализ данных табл. 11—12 показал, что содержание суммы a-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %

В водном извлечении шрота яблок аминокислоты содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (в составе пептидов и белков). С целью повышения выхода суммы аминокислот из шрота яблок нами оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза.

В качестве гидролизующего агента мы использовали раствор кислоты хлороводородной, обеспечивающей достаточно полное расщепление белков и пептидов водного извлечения до а-аминокислот. Кроме того, получаемые гидролизаты характеризуются высокой стабильностью, уменьшается вероятность их микробной контаминации, что является важным фактором при подготовке образцов к анализу.

Нами изучено влияние концентрации раствора кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот. К 5 г высушенного шрота яблок добавляют 35 мл воды и оставляют на 30 мин для набухания. Далее к сырью добавляют 65 мл раствора кислоты хлороводородной в концентрации от 0,45 М до 5,5 М и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 2 ч. Затем гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье, для его более полного истощения, трехкратно экстрагируют водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют и объединяют с гидролизатом.

К объединенному гидролизату добавляют натрия гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. В результате кислотного гидролиза образуется комплекс балластных веществ (в т.ч. и продукты частичного гидролиза ВМС), снижающих качество готового продукта. Для очистки от данных веществ, к 20 мл гидролизата добавляют трехкратный объем 96 % этанола и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Далее нами проведена нингидриновая реакция, как описано выше (при количественном анализе свободных а-аминокислот шрота яблок) и установлено, что гидролиз шрота яблок 0,9 М раствором кислоты хлороводородной обеспечивает наиболее высокий выход суммы аминокислот (табл. 13).

Табл. 13.Влияние концентрации кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот.

Концентрация кислоты хлороводородной, М

5,5

4,6

3,6

1,8

0,9

0,45

Содержание суммы аминокислот в пересчете на пролин, %

0,17

0,31

0,52

0,64

0,85

0,66

В следующей серии экспериментов нами изучено влияние продолжительности гидролиза на выход суммы аминокислот. Кислотный гидролиз проводили 0,9 М раствором кислоты хлороводородной в интервале времени от 1 ч до 12 ч Установлено, что наибольший выход суммы аминокислот из шрота яблок (1,71 % в пересчете на пролин) наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 10 часов (табл. 14). На нейтрализацию полученного извлечения израсходовано 5 г натрия гидрокарбоната.

Таблица 14. Влияние продолжительности кислотного гидролиза на выход суммы аминокислот

Продолжительность гидролиза, ч

Выход суммы аминокислот, %

Продолжительность гидролиза, ч

Выход суммы аминокислот, %

1

0,59

7

1,42

2

0,85

8

1,51

3

0,96

9

1,58

4

1,08

10

1,71

5

1,19

11

1,56

6

1,30

12

1,28

Таким образом, нами оптимизированы условия кислотного гидролиза: к 5 г шрота яблок (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния, добавляют 35 мл воды очищенной и оставляют на 30 мин для набухания. Затем к набухшему сырью добавляют 65 мл 0,9 М раствора кислоты хлороводородной и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 10 ч. Полученный гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье трехкратно экстрагируют водой в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют, объединяют с гидролизатом и проводят нейтрализацию добавлением 5 г натрия гидрокарбоната. Затем гидролизат переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. Далее проводят очистку гидролизата от балластных ВМС добавлением 96 % этанола, как описано выше. Следует отметить, что разработанный метод кислотного гидролиза не связан с использованием дорогого оборудования, характеризуется простотой исполнения и относительно небольшой продолжительностью во времени.

С целью изучения влияния балластных веществ на суммарное количественное содержание а-аминокислот в шроте яблок после гидролиза (в оптимизированных условиях), мы приготовили кислотный гидролизат без очистки от балластных веществ (образец 3) и гидролизат, очищенный от балластных веществ (образец 4) и затем провели нингидриновую реакцию (как описано выше). 2 мл каждого продукта разбавляли водой: до 10 мл (образец 3) и до 5 мл (образец 4).

На основании данных нингидриновой реакции были получены результаты количественного содержания суммы аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза и аналогичный показатель для образца, очищенного от балластных веществ (табл. 15 и 16).

Таблица 15. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза.

эксперимента

Навеска шрота яблок г

Навеска пролина, г

Оптическая плотность при λ = 400 нм продукта реакции

Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %

Водного извлечения

Пролина

1

0,029982

0,000249

0,40423

0,52285

1,509

2

0,029915

0,000244

0,41568

0,52285

1,532

3

0,02993

0,000244

0,41676

0,51884

1,539

4

0,029965

0,000244

0,41873

0,51732

1,549 _

5

0,030015

0,000249

0,41204

0,51762

1,552

6

0,030028

0,000254

0,40520

0,51802

1,555

Таблица 16. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок, очищенного от балластных ВМС, после кислотного гидролиза

эксперимента

Навеска шрота яблок г

Навеска пролина, г

Оптическая плотность при λ= 400 нм продукта реакции

Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %

Водного извлечения

Пролина

1

0,023978

0,000244

0,73493

0,52279

1,681

2

0,023902

0,000249

0,72279

0,51925

1,704

3

0,023895

0,000249

0,72718

0,52012

1,712

4

0,023885

0,000249

0,72709

0,51815

1,719

5

0,023444

0,000244

0,73021

0,51800

1,724

6

0,023815

0,000249

0,73017

0,51946

1,727

Анализ данных табл. 11, 12 и 15, 16 показал, что содержание суммы а-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %. Аналогичный показатель для шрота яблок, подвергнутого кислотному гидролизу составил 1,539 % и 1,711 %, соответственно.

Статистическая обработка результатов анализа представлена в таблице 17, где номер каждого образца соответствует нумерации образцов при их подготовке к количественному определению суммы а-аминокислот.

Таблица 17. Статистическая обработка метода количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок относительно пролина

№ образца

f

<х>, %

s2......

s

P,%

Ax

6, %

1

5

1,532

2,85-1 O'4

1,69-10'"4

95

0,0434

2,83

2

5

1,112

1,03 1 O'4

1,01-КГ2

95

0,026

2,34

3

5

1,539

2,95 10*4

1,72-10'“

95

0,0442

2,87

4

5

1,711

2,89-1 О*4

1,7-10*

95

0,0437

2,55

Как видно из данных таблицы 17, разработанный метод характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью. Относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %. Кроме того, метод прост и доступен в исполнении, не требует дорогостоящего аппаратурного оборудования и может быть использован для количественного определения суммы аминокислот в растительном сырье.

Однако, исходное извлечение шрота яблок (образец 1) и гидролизат (образец 3) содержат вещества, реагирующие с нингидрином (пептиды и белки), влияющие на изменения значений оптической плотности. Это приводит к ошибкам результатов количественного содержания а-аминокислот в сырье. Поэтому, для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы а-аминокислот в растительном сырье, необходимо проводить его очистку от сопутствующих ВМС, например, с помощью осаждения этанолом, как описано выше.

Таким образом, проведение кислотного гидролиза способствует увеличению содержания суммы а-аминокислот в шроте яблок до 1,711 % в пересчете на пролин,что значительно превышает аналогичный показатель для исходного сырья - 1,112 %. Это позволит в дальнейшем разработать на основе кислотного гидролизата малотоксичные препараты широкого спектра фармакологической активности, обогащенные a-аминокислотами.

Приобретение[править]

Читайте также[править]