Количественное определение белка в продуктах

Разработка методики количественного определения суммы аминокислот в шроте яблок

Нами изучена возможность использования нингидриновой реакции в количественном анализе суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок. Кроме того, нами проведена оптимизация и оценка количественного содержания а-аминокислот в сырье после кислотного гидролиза.

Приготовление образца 1. 10,0 г сырья (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния шестикратно экстрагируют горячей водой по 1 ч при температуре 80-90 °С (гидромодуль 1:8). Полученные извлечения фильтруют, объединяют, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят водой до метки (далее - исходное извлечение или образец 1).

С целью изучения влияния балластных веществ на количественное содержание суммы а-аминокислот в шроте яблок, нами приготовлено водное извлечение, очищенное от балластных веществ (образец 2).

Образец 2. К 20 мл исходного извлечения (образца 1) добавляют трехкратный объем 96 % этанола для осаждения балластных ВМС и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Нами установлено, что продукты взаимодействия обоих образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина характеризуются высокой стабильностью во времени: за период 1-1,5 ч после начала реакции их интенсивность светопоглощения при длине волны 400 нм снижается на 0,2-0,5 %.

Нами установлено, что из всех изученных а-аминокислот продукт взаимодействия пролина с нингидрином при длине волны 400 нм характеризуется наибольшей стабильностью (за период 1—1,5 ч после начала реакции интенсивность светопоглощения снижается на 0,2 %). На этом основании мы установили предельные концентрации пролина в нингидриновой реакции, подчиняющиеся закону светопоглощения, а именно 0,016-0,072 мг/мл (рис 17).

Рис 17. Калибровочный график продукта реакции пролина

На этом основании и с учетом ранее оптимизированных условий реакции с водным раствором нингидрина нами разработана методика проведения количественного определения а-аминокислот в шроте яблок.

К 1,5 мл исследуемых извлечений (образцы 1 и 2) добавляют 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения отбирают по 2 мл каждого из продуктов реакции и разбавляют их водой: до 10 мл (образец 1) и до 5 мл (образец 2) и спустя 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Параллельно проводят реакцию 1,5 мл свежеприготовленного 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина, после охлаждения отбирают 2 мл продукта реакции, разбавляют его водой до 5 мл и определяют оптическую плотность в аналогичных условиях. Стандартный образец пролина получен многократной дробной кристаллизацией пролина из этанольно-эфирной смеси.

Содержание суммы аминокислот в образцах относительно пролина вычисляют по формуле:

Х=[Dx*mo*100*a*100%]/[Do*mx*(100-W)*b]

Dx - оптическая плотность продуктов реакции исследуемых образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина;

Do - оптическая плотность продукта реакции 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 0,2 % водным раствором нингидрина;

mо и mх- средние массы навесок стандартного образца пролина и шрота яблок, соответственно, г,

W- остаточная влажность шрота яблок (14,9 %);

а и b - разведения продуктов нингидриновой реакции исследуемых образцов и стандартного образца пролина, соответственно, мл.

На основании проведённых для каждого образца шести параллельных испытаний получены результаты, которые приведены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11. Результаты количественного определения суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок.

№ эксперимента	Навеска шрота яблок г	Навеска пролина, г	Оптическая плотность при λ=400 нм продукта реакции		Содержание 1 суммы аминокислот относительно пролина, %
			Водного извлечения	Пролина
1	0,030001	0,000249	0,40091	0,52065	1,502
2	0,030004	0,000237	0,42839	0,52149	1,525
3	0,029991	0,000239	0,42524	0,51986	1,532
4	0,029995	0,000241	0,42326	0,51932	1,539
5	0,029989	0,000238	0,43000	0,51911	1,545
6	0,029984	0,000236	0,43435	0,51903	1,548

Таблица 12. Результаты количественного определения суммы свободных a-аминокислот в шроте яблок, очищенном от балластных ВМС.

№ 1 эксперимента	Навеска шрота яблок г	Навеска пролина, г	Оптическая плотность при λ= 400 нм продукта реакции		Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %
			Водного извлечения	Пролина
1	0,024000	0,000249	0,46662	0,52000	1,094
2	0,023978	0,000241	0,48768	0,51984	1,108
3	0,023971	0,000239	0,49254	0,51848	1,113
4	0,023985	0,000244	0,48424	0,51824	1,117
5	0,023965	0,000237	0,49895	0,51817	1,119
6	0,023992	0,000245	0,48454	0,51821	1,122

Анализ данных табл. 11—12 показал, что содержание суммы a-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %

В водном извлечении шрота яблок аминокислоты содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (в составе пептидов и белков). С целью повышения выхода суммы аминокислот из шрота яблок нами оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза.

В качестве гидролизующего агента мы использовали раствор кислоты хлороводородной, обеспечивающей достаточно полное расщепление белков и пептидов водного извлечения до а-аминокислот. Кроме того, получаемые гидролизаты характеризуются высокой стабильностью, уменьшается вероятность их микробной контаминации, что является важным фактором при подготовке образцов к анализу.

Нами изучено влияние концентрации раствора кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот. К 5 г высушенного шрота яблок добавляют 35 мл воды и оставляют на 30 мин для набухания. Далее к сырью добавляют 65 мл раствора кислоты хлороводородной в концентрации от 0,45 М до 5,5 М и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 2 ч. Затем гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье, для его более полного истощения, трехкратно экстрагируют водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют и объединяют с гидролизатом.

К объединенному гидролизату добавляют натрия гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. В результате кислотного гидролиза образуется комплекс балластных веществ (в т.ч. и продукты частичного гидролиза ВМС), снижающих качество готового продукта. Для очистки от данных веществ, к 20 мл гидролизата добавляют трехкратный объем 96 % этанола и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Далее нами проведена нингидриновая реакция, как описано выше (при количественном анализе свободных а-аминокислот шрота яблок) и установлено, что гидролиз шрота яблок 0,9 М раствором кислоты хлороводородной обеспечивает наиболее высокий выход суммы аминокислот (табл. 13).

Табл. 13.Влияние концентрации кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот.

Концентрация кислоты хлороводородной, М	5,5	4,6	3,6	1,8	0,9	0,45
Содержание суммы аминокислот в пересчете на пролин, %	0,17	0,31	0,52	0,64	0,85	0,66

В следующей серии экспериментов нами изучено влияние продолжительности гидролиза на выход суммы аминокислот. Кислотный гидролиз проводили 0,9 М раствором кислоты хлороводородной в интервале времени от 1 ч до 12 ч Установлено, что наибольший выход суммы аминокислот из шрота яблок (1,71 % в пересчете на пролин) наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 10 часов (табл. 14). На нейтрализацию полученного извлечения израсходовано 5 г натрия гидрокарбоната.

Таблица 14. Влияние продолжительности кислотного гидролиза на выход суммы аминокислот

Продолжительность гидролиза, ч	Выход суммы аминокислот, %	Продолжительность гидролиза, ч	Выход суммы аминокислот, %
1	0,59	7	1,42
2	0,85	8	1,51
3	0,96	9	1,58
4	1,08	10	1,71
5	1,19	11	1,56
6	1,30	12	1,28

Таким образом, нами оптимизированы условия кислотного гидролиза: к 5 г шрота яблок (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния, добавляют 35 мл воды очищенной и оставляют на 30 мин для набухания. Затем к набухшему сырью добавляют 65 мл 0,9 М раствора кислоты хлороводородной и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 10 ч. Полученный гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье трехкратно экстрагируют водой в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют, объединяют с гидролизатом и проводят нейтрализацию добавлением 5 г натрия гидрокарбоната. Затем гидролизат переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. Далее проводят очистку гидролизата от балластных ВМС добавлением 96 % этанола, как описано выше. Следует отметить, что разработанный метод кислотного гидролиза не связан с использованием дорогого оборудования, характеризуется простотой исполнения и относительно небольшой продолжительностью во времени.

С целью изучения влияния балластных веществ на суммарное количественное содержание а-аминокислот в шроте яблок после гидролиза (в оптимизированных условиях), мы приготовили кислотный гидролизат без очистки от балластных веществ (образец 3) и гидролизат, очищенный от балластных веществ (образец 4) и затем провели нингидриновую реакцию (как описано выше). 2 мл каждого продукта разбавляли водой: до 10 мл (образец 3) и до 5 мл (образец 4).

На основании данных нингидриновой реакции были получены результаты количественного содержания суммы аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза и аналогичный показатель для образца, очищенного от балластных веществ (табл. 15 и 16).

Таблица 15. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза.

№ эксперимента	Навеска шрота яблок г	Навеска пролина, г	Оптическая плотность при λ = 400 нм продукта реакции		Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %
			Водного извлечения	Пролина
1	0,029982	0,000249	0,40423	0,52285	1,509
2	0,029915	0,000244	0,41568	0,52285	1,532
3	0,02993	0,000244	0,41676	0,51884	1,539
4	0,029965	0,000244	0,41873	0,51732	1,549 _
5	0,030015	0,000249	0,41204	0,51762	1,552
6	0,030028	0,000254	0,40520	0,51802	1,555

Таблица 16. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок, очищенного от балластных ВМС, после кислотного гидролиза

№ эксперимента	Навеска шрота яблок г	Навеска пролина, г	Оптическая плотность при λ= 400 нм продукта реакции		Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %
			Водного извлечения	Пролина
1	0,023978	0,000244	0,73493	0,52279	1,681
2	0,023902	0,000249	0,72279	0,51925	1,704
3	0,023895	0,000249	0,72718	0,52012	1,712
4	0,023885	0,000249	0,72709	0,51815	1,719
5	0,023444	0,000244	0,73021	0,51800	1,724
6	0,023815	0,000249	0,73017	0,51946	1,727

Анализ данных табл. 11, 12 и 15, 16 показал, что содержание суммы а-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %. Аналогичный показатель для шрота яблок, подвергнутого кислотному гидролизу составил 1,539 % и 1,711 %, соответственно.

Статистическая обработка результатов анализа представлена в таблице 17, где номер каждого образца соответствует нумерации образцов при их подготовке к количественному определению суммы а-аминокислот.

Таблица 17. Статистическая обработка метода количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок относительно пролина

№ образца	f	<х>, %	s2......	s	P,%	Ax	6, %
1	5	1,532	2,85-1 O'4	1,69-10'"4	95	0,0434	2,83
2	5	1,112	1,03 1 O'4	1,01-КГ2	95	0,026	2,34
3	5	1,539	2,95 10*4	1,72-10'“	95	0,0442	2,87
4	5	1,711	2,89-1 О*4	1,7-10*	95	0,0437	2,55

Как видно из данных таблицы 17, разработанный метод характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью. Относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %. Кроме того, метод прост и доступен в исполнении, не требует дорогостоящего аппаратурного оборудования и может быть использован для количественного определения суммы аминокислот в растительном сырье.

Однако, исходное извлечение шрота яблок (образец 1) и гидролизат (образец 3) содержат вещества, реагирующие с нингидрином (пептиды и белки), влияющие на изменения значений оптической плотности. Это приводит к ошибкам результатов количественного содержания а-аминокислот в сырье. Поэтому, для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы а-аминокислот в растительном сырье, необходимо проводить его очистку от сопутствующих ВМС, например, с помощью осаждения этанолом, как описано выше.

Таким образом, проведение кислотного гидролиза способствует увеличению содержания суммы а-аминокислот в шроте яблок до 1,711 % в пересчете на пролин,что значительно превышает аналогичный показатель для исходного сырья - 1,112 %. Это позволит в дальнейшем разработать на основе кислотного гидролизата малотоксичные препараты широкого спектра фармакологической активности, обогащенные a-аминокислотами.

Читайте также

• Нингидриновая реакция на определение аминокислот и белка
• Количественное определение глицина в таблетках