Количественное определение белка в продуктах
Разработка методики количественного определения суммы аминокислот в шроте яблок
Нами изучена возможность использования нингидриновой реакции в количественном анализе суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок. Кроме того, нами проведена оптимизация и оценка количественного содержания а-аминокислот в сырье после кислотного гидролиза.
Приготовление образца 1. 10,0 г сырья (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния шестикратно экстрагируют горячей водой по 1 ч при температуре 80-90 °С (гидромодуль 1:8). Полученные извлечения фильтруют, объединяют, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят водой до метки (далее - исходное извлечение или образец 1).
С целью изучения влияния балластных веществ на количественное содержание суммы а-аминокислот в шроте яблок, нами приготовлено водное извлечение, очищенное от балластных веществ (образец 2).
Образец 2. К 20 мл исходного извлечения (образца 1) добавляют трехкратный объем 96 % этанола для осаждения балластных ВМС и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.
Нами установлено, что продукты взаимодействия обоих образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина характеризуются высокой стабильностью во времени: за период 1-1,5 ч после начала реакции их интенсивность светопоглощения при длине волны 400 нм снижается на 0,2-0,5 %.
Нами установлено, что из всех изученных а-аминокислот продукт взаимодействия пролина с нингидрином при длине волны 400 нм характеризуется наибольшей стабильностью (за период 1—1,5 ч после начала реакции интенсивность светопоглощения снижается на 0,2 %). На этом основании мы установили предельные концентрации пролина в нингидриновой реакции, подчиняющиеся закону светопоглощения, а именно 0,016-0,072 мг/мл (рис 17).
На этом основании и с учетом ранее оптимизированных условий реакции с водным раствором нингидрина нами разработана методика проведения количественного определения а-аминокислот в шроте яблок.
К 1,5 мл исследуемых извлечений (образцы 1 и 2) добавляют 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения отбирают по 2 мл каждого из продуктов реакции и разбавляют их водой: до 10 мл (образец 1) и до 5 мл (образец 2) и спустя 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Параллельно проводят реакцию 1,5 мл свежеприготовленного 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина, после охлаждения отбирают 2 мл продукта реакции, разбавляют его водой до 5 мл и определяют оптическую плотность в аналогичных условиях. Стандартный образец пролина получен многократной дробной кристаллизацией пролина из этанольно-эфирной смеси.
Содержание суммы аминокислот в образцах относительно пролина вычисляют по формуле:
Х=[Dx*mo*100*a*100%]/[Do*mx*(100-W)*b]
Dx - оптическая плотность продуктов реакции исследуемых образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина;
Do - оптическая плотность продукта реакции 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 0,2 % водным раствором нингидрина;
mо и mх- средние массы навесок стандартного образца пролина и шрота яблок, соответственно, г,
W- остаточная влажность шрота яблок (14,9 %);
а и b - разведения продуктов нингидриновой реакции исследуемых образцов и стандартного образца пролина, соответственно, мл.
На основании проведённых для каждого образца шести параллельных испытаний получены результаты, которые приведены в таблицах 11 и 12.
Таблица 11. Результаты количественного определения суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок.
|
№ эксперимента |
Навеска шрота яблок г |
Навеска пролина, г |
Оптическая плотность при Х=400 нм продукта реакции |
Содержание 1 суммы аминокислот относительно пролина, % | |
|
Водного извлечения |
Пролина | ||||
|
1 |
0,030001 |
0,000249 |
0,40091 |
0,52065 |
1,502 |
|
2 |
0,030004 |
0,000237 |
0,42839 |
0,52149 |
1,525 |
|
3 |
0,029991 |
0,000239 |
0,42524 |
0,51986 |
1,532 |
|
4 |
0,029995 |
0,000241 |
0,42326 |
0,51932 |
1,539 |
|
5 |
0,029989 |
0,000238 |
0,43000 |
0,51911 |
1,545 |
|
6 |
0,029984 |
0,000236 |
0,43435 |
0,51903 |
1,548 |
Таблица 12. Результаты количественного определения суммы свободных a-аминокислот в шроте яблок, очищенном от балластных ВМС.
|
№ 1 эксперимента |
Навеска шрота яблок Г |
Навеска пролина, г |
Оптическая плотность при Х= 400 нм продукта реакции |
Содержание суммы аминокислот относительно пролина, % | |
|
Водного извлечения |
Пролина | ||||
|
1 |
0,024000 |
0,000249 |
0,46662 |
0,52000 |
1,094 |
|
2 |
0,023978 |
0,000241 |
0,48768 |
0,51984 |
1,108 |
|
3 |
0,023971 |
0,000239 |
0,49254 |
0,51848 |
1,113 |
|
4 |
0,023985 |
0,000244 |
0,48424 |
0,51824 |
1,117 |
|
5 |
0,023965 |
0,000237 |
0,49895 |
0,51817 |
1,119 |
|
6 |
0,023992 |
0,000245 |
0,48454 |
0,51821 |
1,122 |
Анализ данных табл. 11—12 показал, что содержание суммы a-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %
В водном извлечении шрота яблок аминокислоты содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (в составе пептидов и белков). С целью повышения выхода суммы аминокислот из шрота яблок нами оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза.
В качестве гидролизующего агента мы использовали раствор кислоты хлороводородной, обеспечивающей достаточно полное расщепление белков и пептидов водного извлечения до а-аминокислот. Кроме того, получаемые гидролизаты характеризуются высокой стабильностью, уменьшается вероятность их микробной контаминации, что является важным фактором при подготовке образцов к анализу.
Нами изучено влияние концентрации раствора кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот. К 5 г высушенного шрота яблок добавляют 35 мл воды и оставляют на 30 мин для набухания. Далее к сырью добавляют 65 мл раствора кислоты хлороводородной в концентрации от 0,45 М до 5,5 М и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 2 ч. Затем гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье, для его более полного истощения, трехкратно экстрагируют водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют и объединяют с гидролизатом.
К объединенному гидролизату добавляют натрия гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. В результате кислотного гидролиза образуется комплекс балластных веществ (в т.ч. и продукты частичного гидролиза ВМС), снижающих качество готового продукта. Для очистки от данных веществ, к 20 мл гидролизата добавляют трехкратный объем 96 % этанола и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.
Далее нами проведена нингидриновая реакция, как описано выше (при количественном анализе свободных а-аминокислот шрота яблок) и установлено, что гидролиз шрота яблок 0,9 М раствором кислоты хлороводородной обеспечивает наиболее высокий выход суммы аминокислот (табл. 13).
Табл. 13.Влияние концентрации кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот.
|
Концентрация кислоты хлороводородной, М |
5,5 |
4,6 |
3,6 |
1,8 |
0,9 |
0,45 |
|
Содержание суммы аминокислот в пересчете на пролин, % |
0,17 |
0,31 |
0,52 |
0,64 |
0,85 |
0,66 |
В следующей серии экспериментов нами изучено влияние продолжительности гидролиза на выход суммы аминокислот. Кислотный гидролиз проводили 0,9 М раствором кислоты хлороводородной в интервале времени от 1 ч до 12 ч Установлено, что наибольший выход суммы аминокислот из шрота яблок (1,71 % в пересчете на пролин) наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 10 часов (табл. 14). На нейтрализацию полученного извлечения израсходовано 5 г натрия гидрокарбоната.
Таблица 14. Влияние продолжительности кислотного гидролиза на выход суммы аминокислот
|
Продолжительность гидролиза, ч |
Выход суммы аминокислот, % |
Продолжительность гидролиза, ч |
Выход суммы аминокислот, % |
|
1 |
0,59 |
7 |
1,42 |
|
2 |
0,85 |
8 |
1,51 |
|
3 |
0,96 |
9 |
1,58 |
|
4 |
1,08 |
10 |
1,71 |
|
5 |
1,19 |
11 |
1,56 |
|
6 |
1,30 |
12 |
1,28 |
Таким образом, нами оптимизированы условия кислотного гидролиза: к 5 г шрота яблок (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния, добавляют 35 мл воды очищенной и оставляют на 30 мин для набухания. Затем к набухшему сырью добавляют 65 мл 0,9 М раствора кислоты хлороводородной и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 10 ч. Полученный гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье трехкратно экстрагируют водой в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют, объединяют с гидролизатом и проводят нейтрализацию добавлением 5 г натрия гидрокарбоната. Затем гидролизат переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. Далее проводят очистку гидролизата от балластных ВМС добавлением 96 % этанола, как описано выше. Следует отметить, что разработанный метод кислотного гидролиза не связан с использованием дорогого оборудования, характеризуется простотой исполнения и относительно небольшой продолжительностью во времени.
С целью изучения влияния балластных веществ на суммарное количественное содержание а-аминокислот в шроте яблок после гидролиза (в оптимизированных условиях), мы приготовили кислотный гидролизат без очистки от балластных веществ (образец 3) и гидролизат, очищенный от балластных веществ (образец 4) и затем провели нингидриновую реакцию (как описано выше). 2 мл каждого продукта разбавляли водой: до 10 мл (образец 3) и до 5 мл (образец 4).
На основании данных нингидриновой реакции были получены результаты количественного содержания суммы аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза и аналогичный показатель для образца, очищенного от балластных веществ (табл. 15 и 16).
Таблица 15. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза.
|
№ эксперимента |
Навеска шрота яблок г |
Навеска пролина, г |
Оптическая плотность при X = 400 нм продукта реакции |
Содержание суммы аминокислот относительно пролина, % | |
|
Водного извлечения |
Пролина | ||||
|
1 |
0,029982 |
0,000249 |
0,40423 |
0,52285 |
1,509 |
|
2 |
0,029915 |
0,000244 |
0,41568 |
0,52285 |
1,532 |
|
3 |
0,02993 |
0,000244 |
0,41676 |
0,51884 |
1,539 |
|
4 |
0,029965 |
0,000244 |
0,41873 |
0,51732 |
1,549 _ |
|
5 |
0,030015 |
0,000249 |
0,41204 |
0,51762 |
1,552 |
|
6 |
0,030028 |
0,000254 |
0,40520 |
0,51802 |
1,555 |
Таблица 16. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок, очищенного от балластных ВМС, после кислотного гидролиза
|
№ эксперимента |
Навеска шрота яблок г |
Навеска пролина, г |
Оптическая плотность при \= 400 нм продукта реакции |
Содержание суммы аминокислот относительно пролина, % | |
|
Водного извлечения |
Пролина | ||||
|
1 |
0,023978 |
0,000244 |
0,73493 |
0,52279 |
1,681 |
|
2 |
0,023902 |
0,000249 |
0,72279 |
0,51925 |
1,704 |
|
3 |
0,023895 |
0,000249 |
0,72718 |
0,52012 |
1,712 |
|
4 |
0,023885 |
0,000249 |
0,72709 |
0,51815 |
1,719 |
|
5 |
0,023444 |
0,000244 |
0,73021 |
0,51800 |
1,724 |
|
6 |
0,023815 |
0,000249 |
0,73017 |
0,51946 |
1,727 |
Анализ данных табл. 11, 12 и 15, 16 показал, что содержание суммы а-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %. Аналогичный показатель для шрота яблок, подвергнутого кислотному гидролизу составил 1,539 % и 1,711 %, соответственно.
Статистическая обработка результатов анализа представлена в таблице 17, где номер каждого образца соответствует нумерации образцов при их подготовке к количественному определению суммы а-аминокислот.
Таблица 17. Статистическая обработка метода количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок относительно пролина
|
№ образца |
f |
<х>, % |
s2......| |
s |
P,% |
Ax |
6, % |
|
1 |
5 |
1,532 |
2,85-1 O'4 |
1,69-10'"4 |
95 |
0,0434 |
2,83 |
|
2 |
5 |
1,112 |
1,03 1 O'4 |
1,01-КГ2 |
95 |
0,026 |
2,34 |
|
3 |
5 |
1,539 |
2,95 10*4 |
1,72-10'“ |
95 |
0,0442 |
2,87 |
|
4 |
5 |
1,711 |
2,89-1 О*4 |
1,7-10* |
95 |
0,0437 |
2,55 |
Как видно из данных таблицы 17, разработанный метод характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью. Относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %. Кроме того, метод прост и доступен в исполнении, не требует дорогостоящего аппаратурного оборудования и может быть использован для количественного определения суммы аминокислот в растительном сырье.
Однако, исходное извлечение шрота яблок (образец 1) и гидролизат (образец 3) содержат вещества, реагирующие с нингидрином (пептиды и белки), влияющие на изменения значений оптической плотности. Это приводит к ошибкам результатов количественного содержания а-аминокислот в сырье. Поэтому, для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы а-аминокислот в растительном сырье, необходимо проводить его очистку от сопутствующих ВМС, например, с помощью осаждения этанолом, как описано выше.
Таким образом, проведение кислотного гидролиза способствует увеличению содержания суммы а-аминокислот в шроте яблок до 1,711 % в пересчете на пролин,что значительно превышает аналогичный показатель для исходного сырья - 1,112 %. Это позволит в дальнейшем разработать на основе кислотного гидролизата малотоксичные препараты широкого спектра фармакологической активности, обогащенные a-аминокислотами.
