Генная терапия отдельных заболеваний
Источник:
Клиническая фармакология по Гудману и Гилману том 1.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.
Содержание
Генная терапия отдельных заболеваний
В этой статье описано применение генотерапии для лечения различных наследственных заболеваний иммунной системы, крови, печени, легких и скелетных мышц. Здесь упомянуты далеко не все болезни, для которых разрабатываются методы генотерапии. Обсуждаемые вопросы призваны проиллюстрировать основные методы и проблемы генной терапии.
Врожденные иммунодефициты
Генная терапия врожденных иммунодефицитов основана на трансфекции стволовых кроветворных клеток ex vivo. Сейчас проводят экспериментальные и клинические исследования методов лечения трех врожденных иммунодефицитов: недостаточности аденозиндезаминазы, Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита и хронической гранулематозной болезни. Эффективность генотерапии этих заболеваний пока ограничена из-за низкого уровня трансфекции. Впрочем, в недавнем исследовании удалось повысить уровень трансфекции ретровирусного вектора при Х-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците с помощью новых способов культивирования клеток (Cavazzana-Calvo et al., 2000).
Недостаточность аденозиндезаминазы. Первое наследственное заболевание, для лечения которого была применена генная терапия, — это недостаточность аденозиндезаминазы (Parkman et al., 2000). Отсутствие этого фермента ведет к накоплению токсичного для лимфоцитов дезокси-АТФ. Вследствие поражения гуморального и клеточного иммунитета у больных возникают частые тяжелые инфекции. Обычный метод лечения заключается в трансплантации костного мозга и периодическом в/в введении рекомбинантного фермента, конъюгированного с полиэтиленгликолем. В первом клиническом испытании двум больным ввели их собственные Т-лимфоциты после трансфекции ретровирусным вектором, содержавшим ген аденозиндезаминазы человека (Blaese et al., 1995).
У одного из этих больных длительное время сохранялись модифицированные Т-лимфоциты, а у другого эффект был незначительный. Первый больной живет нормальной жизнью уже несколько лет после лечения, симптоматика у него ослаблена (Anderson, 2000).
Исходя из тех соображений, что зрелые Т-лимфоциты не могут восстановить функцию иммунной системы в полном объеме, в последующих клинических испытаниях применяли трансфекцию ex vivo стволовых кроветворных клеток. Такие клетки способны дифференцироваться в любые клетки крови. К сожалению, в большинстве случаев эффективность трансфекции стволовых кроветворных клеток, полученных из костного мозга, периферической крови или крови пуповины, невелика (Halene and Kohn,2000). Кроме того, трансгены, введенные с помощью ретровирусных векторов, малоактивны в покоящихся, неделяшихся Т-лимфоцитах (Parkman et al., 2000). Возможно, с помощью лентивирусных векторов удастся повысить эффективность трансфекции (Case etal., 1999), но существуют сомнения в их безопасности.
Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит. При наиболее распространенной форме тяжелого комбинированного иммунодефицита мутация гена, расположенного на Х-хромосоме и кодирующего общую у-субъединицу (ус) рецепторов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-15, приводит к нарушению дифференцировки лимфоцитов и смертельному нарушению иммунитета. Как и при недостаточности аденозиндезаминазы, перспективной считается генотерапия с использованием стволовых кроветворных клеток. В недавнем исследовании в стволовые кроветворные клетки с помощью ретровирусного вектора ex vivo вводили нормальный ген ус-субъединицы, а клетки затем вводили двум детям с Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Cavazzana-Calvo et al., 2000). Через 10 мес у обоих детей было нормальное число Т-лимфоцитов, а функция лимфоцитов крови свидетельствовала об экспрессии в них ус-субъединицы. Успех этой работы объясняется изменением условий содержания клеток в культуре: на поверхность среды наносили фрагменты фибронектина и добавляли особую смесь цитокинов (фактор стволовых клеток, фактор дифференцировки мегакариоцитов, цито-кин FL). Цитокины стимулировали деление стволовых клеток и способствовали их заражению ретровирусами, а фибронектин увеличивал эффективность трансфекции, облегчая взаимодействие клетки с вирусом.
Хроническая гранулематозная болезнь. Это заболевание возникает в результате генетических дефектов, нарушающих функцию цитохрома Ь558 или НАДФН-оксидазы. Эти ферменты участвуют в выработке супероксидных радикалов в фагоцитах, а их недостаточность приводит к угрожающему жизни ослаблению иммунитета к бактериальным и грибковым инфекциям. По-видимому, для клинического улучшения достаточно ввести нормальный ген лишь в небольшую часть фагоцитов крови, так как при Х-сцепленной форме болезни у здоровых женщин-носителей всего 5% нейтрофилов имеют активную НАДФН-оксидазу. Для лечения обычно применяют аллотрансплантацию костного мозга, хотя генотерапия теоретически имеет много преимуществ. В проводимых сейчас исследованиях мишенями генотерапии служат гены CYBB, кодирующий (3-субъединицу цитохрома Ь558, и NCF1, кодирующий белок-активатор НАДФН-оксидазы (Kume and Dinauer, 2000). В клинических испытаниях, проведенных на пяти больных с дефицитом белка-активатора НАДФН-оксидазы, в/в введение стволовых клеток, в которые ex vivo с помощью ретровирусного вектора был введен ген NCF1, приводило к появлению полноценных гранулоцитов (Malech et al., 1997). Эти гранулоциты находились в крови в течение 6 мес после введения, хотя их количество было недостаточно для клинического улучшения. Для успешного лечения необходимо увеличить эффективность трансфекции стволовых клеток и продолжительность лечебного действия.
Болезни печени
Принципы генотерапии разработаны для различных нарушений обмена веществ, инфекций и злокачественных новообразований, поражающих печень. Задачу облетает существование многочисленных методов доставки генов в клетки печени. Для этого используют молекулярные конъюгаты, аденовирусные и ретровирусные векторы, липосомы (Shetty et al.. 2000). Для трансфекции in vivo применяют следующие пути введения трансгенов: непосредственно в печень, в/в или в желчные пути. Для трансфекции ex vivo проводят резекцию печени, выделяют гепатоциты, вводят в них трансгсны и модифицированные клетки трансплантируют обратно в печень.
Избирательность доставки трансгенов в печень может быть обеспечена специфическими рецепторами гепатоцитов, способными инициировать эндоцитоз (Smith and Wu, 1999). Так, в одних экспериментах лиганды, распознаваемые рецепторами асиалогликопротеидов, присоединяли к полимеру (например, полилизину) или к компонентам липосом, то есть к носителям, способным образовать комплекс с ДНК. В других — модифицировали белки внешней оболочки ретровирусных векторов, например, включали в них участок фактора роста гепатоцитов (Nguyen et al., 1998). Некоторые вирусные векторы имеют естественную тропность к клеткам печени. Приблизительно 90% аденовирусных векторов, введенных в/в, быстро поглощаются печенью. В этом процессе, по-видимому, участвуют концевые домены (головки) нитей аденовирусов (рис. 5.2) (Zinn et al., 1998).
Семейная гиперхолестеринемия (гиперлипопротеидемия типа II). При этом заболевании снижается количество рецепторов ЛПНП или нарушается их функция. В результате печень теряет способность захватывать из крови ЛПНП, поэтому в плазме значительно повышается уровень холестерина, и уже в молодом возрасте развивается атеросклероз (гл. 36). Лекарственные средства при этой болезни малоэффективны, но после трансплантации печени содержание липидов в крови нормализуется, а развитие атеросклероза замедляется. Если методами генотерапии удастся восстановить синтез рецепторов ЛПНП в печени, то можно ожидать аналогичного лечебного эффекта. В экспериментах на кроликах с наследственной гиперлипопротеидемией (линия Ватанабе), которые представляют собой идеальную модель семейной гиперхолестеринемии, показано, что генотерапия ведет к стойкому снижению концентрации ЛПНП в сыворотке (Chowdhury et al., 1991). Сейчас проходят клинические испытания, в которых нескольким больным были трансплантированы их собственные генетически модифицированные гепатоциты. Гепатоциты получали после резекции печени, а затем ex vivo с помощью ретровирусного вектора в них вводили ген рецептора ЛПНП (Chowdhury et al.,1991). В этом исследовании показана принципиальная возможность, безопасность и эффективность генотерапии при поражении печени.
Гемофилия А. Наследственный дефицит фактора VIII многократно повышает риск тяжелых, опасных для жизни кровотечений. Обычно лечение заключается в частом введении препаратов фактора VIII, что помимо неудобства сопряжено с риском инфекции. Гемофилия А хорошо подходит для генотерапии, поскольку в широком диапазоне концентраций фактор VIII не оказывает побочного действия, алечебное действие наблюдается даже при концентрации, составляющей 5% нормальной (Кау and High, 1999). Попытки вызвать эктопический синтез фактора VIII (в отличие от фактора IX) не имели большого успеха. Неудачу объяснили тем, что полная длина колирующего участка гена фактора VIII составляет 7000 нуклеотидов, поэтому для трансфекции можно использовать только ретровирусные и аденовирусные векторы (Ваlague et al., 2000; VandenDriessche et al., 1999). Однако оказалось возможным создать аденоассоциированный вектор, содержащий укороченный ген фактора VI11 (Chao et al., 2000). Длина такого гена (4400 нуклеотидов) позволяет легко встроить его в аденоассоциированный вектор, а укороченный (лишенный домена В) фактор VIII полностью сохраняет свою активность.
С помощью различных вирусных векторов удалось получить длительную экспрессию фактора VIII в печени экспериментальных животных (Kaufman, 1999). Вектор вводили в/в, хотя при этом может происходить трансфекция клеток и других органов, таких, как селезенка и легкие. В некоторых работах использовали трансфекцию сх vivo. В стволовые кроветворные клетки из костного мозга человека с помощью ретровирусного вектора вводили ген фактора VIII, а затем эти клетки трансплантировали в селезенку мышей с иммунодефицитом (Chuah et al., 2000). После приживления клеток концентрация фактора VIII в крови мышей значительно увеличивалась, но экспрессия трансгена была непродолжительной.
Основная проблема в генной терапии гемофилии — возможность выработки антител против чужеродных для организма факторов, кодируемых трансгеном. Выработка антител обычно происходит и при введении препаратов факторов VIII и IX. По-видимому, риск выработки антител при генотерапии зависит от выбора вектора, дозы и ткани-мишени (Kaufman, 1999).
Гемоглобинопатии
Серповидноклеточная анемия и талассемии — распространенные тяжелые моногенные болезни. Теоретически эти заболевания можно лечить с помощью трансфекции стволовых кроветворных клеток ex vivo с последующим введением больному. Основной трудностью является создание векторов, способных к длительной экспрессии трансгенов и синтезу достаточного количества нормального белка глобина (Emery and Stamatoyannopoulos, 1999; Persons and Nienhuis, 2000). Кроме того, разрабатываются методы генотерапии. основанные на транс-сплайсинге с помощью рибозимов и химеропластике (см. выше).
На сегодняшний лень наиболее успешным методом оказалось использование ретровирусных векторов, содержащих ген β-цепи глобина и различные участки локус-контролирующей области — основного регулятора транскрипции всего кластера генов P-цепей глобина. Хотя в стволовые кроветворные клетки с помощью ретровирусных векторов были успешно введены гены P-цепей глобина человека, длительной экспрессии этих генов в костном мозге экспериментальных животных добиться пока не удалось. Возможно, применение лентивирусных векторов позволит повысить эффективность трансфекции и встраивания генов p-цепей глобина вместе с большими участками ло-кус-контролирующей области в геном стволовых кроветворных клеток (May et al., 2000).
Слабая и преходящая экспрессия генов p-цепей глобина в стволовых кроветворных клетках после трансплантации объясняется замолканием трансгена и нестабильным эффектом положения (Rivella and Sadelain, 1998). Замолкание трансгена — это, скорее всего, эпигенетический процесс, приводящий к подавлению экспрессии у потомков модифицированной стволовой клетки. Возможно, эту проблему удастся решить, удалив из вектора или изменив некоторые последовательности вирусных длинных концевых повторов. Нестабильный эффект положения ведет к большим различиям в экспрессии трансгена у потомков модифицированной стволовой клетки, несмотря на одинаковое положение трансгена в геноме. Ретровирусные векторы, содержащие очень большие участки локус-контролирующей области, нестабильны и в процессе репродукции подвержены генетическим перестройкам.
Отбор клеток после трансфекции снижает риск замолкания трансгена и постепенного снижения экспрессии с возрастом животного. При этом отбирают только такие стволовые кроветворные клетки, в которых трансген активен. Критерием отбора ex vivo может быть синтез белка-маркера (Kalberer et al.2000). Другой подход основан на негативной селекции: в стволовые кроветворные клетки одновременно вводят второй трансген, обеспечивающий устойчивость к какому-либо цитотоксическому препарату (Emery and Stamatoyannopoulos, 1999).
Болезни легких
Легкие представляют уникальную возможность доставки генетических векторов непосредственно в эпителий дыхательных путей. В клинических испытаниях генетический материал обычно вводят в виде аэрозоля (Ennist, 1999). Однако, несмотря на кажущуюся доступность, эпителий дыхательных путей исключительно устойчив к внедрению чужеродных частиц, будь то вирусные векторы или невирусные системы доставки генов. Существуют многочисленные препятствия к введению генов в клетки эпителия с помощью аэрозолей (Boucher, 1999): восходящий ток слизи, удаляющий введенные препараты из дыхательных путей; гликокаликс, препятствующий связыванию с клеточными рецепторами; низкая плотность рецепторов на апикальной мембране клетки и ее ограниченная способность к эндоцитозу.
Для генотерапии наследственных болезней легких использовали несколько систем доставки генов (Albelda et al., 2000). Идеально подходят для этой цели аденовирусные векторы, поскольку они обладают естественной тропностью к эпителию дыхательных путей. Однако в нескольких исследованиях была показана низкая эффективность этих векторов вследствие кратковременности экспрессии трансгена и способности вызывать иммунный ответ (Welsh, 1999). Аденоассоциированные векторы, возможно, обеспечат более стойкую экспрессию и меньшую иммуногенность.
Муковисцидоз. Более 10 лет назад был открыт ген CFTR, мутации которого вызывают муковисцидоз. С той поры осуществлены многочисленные попытки разработать безопасный и эффективный способ доставки нормальных копий этого гена в эпителий дыхательных путей больных (Boucher, 1999). Опубликованы результаты нескольких клинических испытаний, в большинстве случаев в них использовали аденовирусные векторы с целью трансфекции эпителия носовой полости или легких. В целом аденовирусные векторы способны осуществить доставку генов, однако при их применении доля модифицированных клеток незначительна, а экспрессия трансгена обычно продолжается не более нескольких суток (Grubb et al., 1994; Zuckerman et al., 1999). Кроме того, иммунный ответ снижает эффективность последующих введений вектора (Harvey et al., 1999).
Сейчас проводят клинические испытания аденоассоциированных векторов. В экспериментальных исследованиях с помощью этих векторов была получена длительная экспрессия трансгена на фоне незначительного иммунного ответа. В одном клиническом испытании десяти больным муковисцидозом ген CFTR вводили в клетки эпителия верхнечелюстных пазух (Drapkin et al., 2000). Получены обнадеживающие результаты, однако предстоит еще многое сделать, чтобы выяснить долговременную безопасность и эффективность этого вектора. Изучается и доставка векторов с помощью липосом. Данные трех клинических испытаний подтверждают возможность такой доставки. Однако, как и в случае аденовирусного вектора, с помощью липосом удалось достичь лишь кратковременной экспрессии трансгена (Albelda et al., 2000).
Сейчас проверяется несколько новых подходов, повышающих эффективность трансфекции клеток эпителия дыхательных путей с помощью вирусных векторов. Поскольку большинство рецепторов к вирусным векторам находится на базолатеральной мембране этих клеток, разрыв плотных контактов, как показывают эксперименты, увеличивает эффективность трансфекции при нанесении вектора на апикальную мембрану клетки (Boucher, 1999). Однако вряд ли этот подход удастся безопасно применить в клинике. В других исследованиях вектор модифицировали таким образом, чтобы обеспечить взаимодействие с рецепторами апикальной мембраны. Два таких модифицированных вектора повышали эффективность трансфекции in vitro: одному придавали сродство к пуриновым рецепторам с помощью моноклональных антител (Boucher, 1999), а второму — к рецепторам урокиназы с помощью небольших пептидных лигандов (Drapkin et al., 2000).
Недостаточность а1-антитрипсина. Это наследственное заболевание ведет к эмфиземе легких и циррозу печени. Ткань легких становится чувствительной к повреждающему действию протеаз нейтрофилов, которые выделяются в очагах воспаления. Хотя а1-антитрипсин в норме не вырабатывается эпителием дыхательных путей, считается, что введение гена а1-антитрипсина в эти клетки окажет защитное действие налегкие (Albelda et al., 2000).
Сейчас для лечения обычно используют рекомбинантный агантитрипсин. Препарат стоит очень дорого, его вводят в виде еженедельных в/в инфузий, что сопряжено с риском осложнений. В доклинических исследованиях показано, что трансгены в составе комплекса плазмиды с катионными липосомами можно ввести в легкие через кровь или через дыхательные пути (Canonico et al., 1994). В одном клиническом испытании комплекс плазмиды с липосомами использовали для доставки гена а1-антитрипсина в эпителий носовой полости больных с недостаточностью этого белка, после чего локальная внеклеточная концентрация осрантитрипсина достигла трети от нормальной величины (Brigham et al., 2000). Кроме того, экспрессия трансгена в слизистой носовой полости оказывала местное противовоспалительное действие, которое отсутствовало при длительном лечении путем в/в инфузий рекомбинантного белка.
Миопатии
Огромный интерес вызывает генотерапия наследственных заболеваний скелетных мышц, включая миопатию Дюшенна и тазово-плечевую миопатию. Зрелая ткань скелетных мышц имеет ряд уникальных особенностей — как облегчающих, так и затрудняющих доставку трансгенов (Hartigan-O’Connorand Chamberlain, 2000). Провести локальную трансфекцию клеток скелетных мышц можно путем прямой инъекции плазмидной ДНК, с помощью вирусного вектора или другого способа доставки.
Кроме того, можно осуществить трансфекцию миобластов ex vivo (Floyd et al., 1998).
Системная доставка генов в мышцы затруднена из-за большой массы ткани и барьера на пути векторов из сосудистого русла к мембране миоцитов, состоящего из эндотелия сосудов и внеклеточного матрикса. Было разработано несколько способов преодоления этого барьера. Наиболее успешным было применение медиатора воспаления гистамина. Водном исследовании в бедренные артерии хомяков с кардиомиопатией, вызванной мутацией гена 5-саркогликана, последовательно вводили вазодилататор (папаверин), гистамин и аденоассоциированный вектор, содержавший маркерный ген (например, ген р-галактозидазы) или нормальный ген S-саркогликана (Greelish et al., 1999). Гистамин увеличивал проницаемость барьера в мышцах задних конечностей, что обеспечивало эффективное введение обоих трансгенов в клетки разных участков мышц.
Существуют и другие препятствия для трансфекции мышечных клеток с помощью некоторых вирусных векторов. Аденовирусы плохо заражают зрелую скелетную мышцу, поскольку на поверхности мышечных клеток мало рецепторов вирусов Коксаки и аденовирусов, необходимых для прикрепления к клетке и интернализации вируса (Nalbantoglu et al., 1999). Более эффективной трансфекции можно добиться на незрелых мышечных волокнах (Acsadi et al., 1994). Напротив, при использовании герпесвирусного вектора эффективность трансфекции in vitro не зависит от степени зрелости клеток (van Deutekom et al., 1998). С помощью аденовирусного вектора удалось ввести трансген в скелетные мышцы экспериментальных животных, но в большинстве случаев его экспрессия была непродолжительной из-за иммунного ответа на вирусную инфекцию. Аденовирусные векторы также способны вызывать трансфекцию скелетных мышц взрослых животных (Fisher et al., 1997). В некоторых экспериментах экспрессия трансгена продолжалась на протяжении 2 лет.
Миопатия Дюшенна. Это Х-сцепленное рецессивное заболевание, вызванное отсутствием цитоскелетного белка дистрофина. Длина нуклеотидной последовательности, кодирующей дистрофии, очень велика (14 000 нуклеотидов), поэтому для ее доставки нельзя использовать вирусные векторы ограниченной емкости, такие, как аденовирусные векторы первого поколения и аденоассоциированные векторы. Новейшие аденовирусные векторы, способные нести полный ген дистрофина, в экспериментах на животных с миопатией (например, мышах линии mdx) вызывали трансфекцию мышечных клеток при введении в мышцу (Clemens et al., 1996). Кроме того, вирусные векторы, содержащие ген утрофина (родственный дистрофину белок), оказывают положительный эффект у мышей линии mdx (Rafael et al., 1998).
Тазово-плечевая миопатия. Это группа сходных наследственных заболеваний, включающая несколько генетических форм. Причиной четырех форм заболевания являются мутации генов а-, β-, у- и 8-саркогликанов. Саркогликаны — это трансмембранные гликопротеиды, образующие комплекс с дистрофином. Заболевание, вызванное дефектом в одном из этих гликопротеидов, во многом сходно с миопатией Дюшенна. В отличие от дистрофина, саркогликаны имеют небольшие размеры, и кодирующие их последовательности длиной менее 2000 нуклеотидов могут быть легко включены в аденоассоциированный вектор. Эксперименты показали возможность восстановления синтеза саркогликанов у мышей и хомяков с миопатией (Greelish et al., 1999). Сейчас проводятся клинические испытания эффективности и безопасности в/м введения гена саркогликана в составе аденоассоциированного вектора (Stedman et al., 2000).
