Спорт-вики — википедия научного бодибилдинга
Изменения
→Ретровирусы
'''Конструкция и получение вектора'''. Ретровирусные векторы получают из соответствующего провируса. Гены gag, pol и env удаляют, чтобы освободить место для нового генетического материала и предотвратить репродукцию вируса (рис. 5.1). В ретровирусный вектор может быть включено до 8000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Поскольку рекомбинантный вирус не может синтезировать вирусные мРНК, то в трансфицированных клетках отсутствует и синтез вирусных белков, которые могли бы вызвать иммунный ответ. Вместе с геном, предназначенным для лечения, в вектор можно ввести промотор и энхан-сер, обеспечивающие эффективную экспрессию трансгена и, в ряде случаев, ее тканеспецифичность. Можно использовать также вирусные промотор и энхансер, расположенные в области длинных концевых повторов (LTR).
После удаления генов, кодирующих вирусные белки и обеспечивающих репродукцию вируса, вирус способен репродуцироваться только в специально созданных линиях упаковывающих клеток, синтезирующих эти белки (рис. 5.1). В геном этих клеток встраивают вирусные гены (gag, pol и env) таким образом, чтобы они находились на разных хромосомах. Это снижает вероятность обратной рекомбинации этих генов в исходный вирусный геном и образования вирусов, способных к репродукции. После введения рекомбинантной ДН К провируса в упаковывающие клетки последние начинают производить ретровирусный вектор. ДНК провируса вводят в виде плазмиды, в которой между двумя длинными концевыми повторами заключены небольшой участок гена gag с сигналом сборки и чужеродные гены. Трансфекцию Трансдукцию упаковывающих клеток осуществляют стандартным методом. Разработано несколько модификаций этого подхода, призванных снизить вероятность рекомбинации с образованием вируса, способного к репродукции (Jolly, 1994).
'''''Описание к рисунок 5.1.''' Использование ретровирусного вектора. А. Схема получения ретровирусного вектора. Для получения не способных к репродукции ретровирусных векторов используют специальные линии клеток, способные синтезировать те вирусные белки, гены которых удалены при конструировании вектора. В клетки подходящей линии (например, эмбриональные клетки почки человека) с помощью бактериальных плазмид вводят гены gag (G), pol (Р) и env (Е). Клетки, синтезирующие соответствующие вирусные белки, называют упаковывающими. Затем плазмиду, содержащую рекомбинантную ДНК провируса, в которой вместо генов gag, pol и env находится нужный трансген, используют для трансфекции трансдукции упаковывающих клеток. Теперь клетки содержат все, что нужно для сборки вирусов, и ретровирусные векторы начинают накапливаться в культуральной среде. Эти векторы содержат трансген, но лишены вирусных генов gag, pol и env, а потому при заражении следующей клетки они не могут репродуцироваться. Б. Экспрессия трансгена в клетке-мишени после внедрения РНК-содержащего ретровирусного вектора (см. «Жизненный цикл»).''
'''Клетки-мишени'''. Способность вируса избирательно заражать определенные типы клеток в значительной степени определяется взаимодействием между белком внешней оболочки вируса (у ретровирусов кодируется геном env) и соответствующим мембранным рецептором клетки. Вирус лейкоза мышей Молони является экотропным, то есть заражает только клетки мышей. Для расширения круга клеток-мишеней используют ген env штамма 4070А вируса лейкоза мышей. Этот штамм является амфотропным и заражает клетки не только мышей, но и других млекопитающих, в том числе — человека. Псевдотипирование, то есть упаковка вирусного генома в оболочку, содержащую белки другого вируса, позволяет расширить круг клеток-мишеней. Например, гликопротеид вируса везикулярного стоматита, называемый G-белком (не путать с G-белками, участвующими во внутриклеточной передаче сигнала; гл. 2), легко включается в оболочку вируса лейкоза мышей Молони (Chen et al., 1996). Наличие этого белка расширяет круг клеток-мишеней и облегчает заражение. Кроме того, включение G-белка повышает стабильность ретровирусного вектора и позволяет при ультрацентрифугировании получить более высокий титр вирусов. Недостаток G-белка — его токсичность по отношению к упаковывающим клеткам. Этот недостаток можно частично преодолеть, используя упаковывающие клетки с индуцируемой экспрессией G-белка (lida et all 1996). Ретровирусные векторы, содержащие другие вирусные белки, например белки вируса лейкоза гиббонов (Gallardo et al., 1997) или вируса лимфоцитарного хориоменингита (Miletic et al., 1999), менее токсичны по отношению к клеткам млекопитающих.
'''Применение'''. С помощью ретровирусных векторов обычно осуществляют трансфекцию трансдукцию клеток больного ex vivo или векторы вводят непосредственно в ткани. Первый подход требует выделения клеток больного и поддержания их в культуре, заражения клеток ретровирусным вектором и последующего введения клеток больному. Так пытались модифицировать лимфоциты и стволовые кроветворные клетки при недостаточности аденозиндезаминазы (Parkman et al., 2000) и семейной гиперхолестеринемии (Grossman et al., 1994). Аналогичным образом поступали, чтобы вызвать экспрессию иммуномодуляторов в опухолевых клетках (Lode and Reisfeld, 2000). Прямую инъекцию ретровирусных векторов пробуют применять в основном для лечения солидных опухолей (Gomez-Navarro et al., 1999).
'''Безопасность'''. Поскольку вирус встраивается в клеточный геном (что важно для длительной экспрессии), причем случайным образом, существует риск возникновения мутации (инсер-ционный мутагенез). Например, встраивание вируса может изменить функцию гена, регулирующего деление клеток, что приведет к нежелательным последствиям. Способные к репродукции ретровирусы обладают некоторой канцерогенностью, однако этого не наблюдается у ретровирусных векторов, лишенных такой способности.
